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酶切專家金蟲 (小有名氣)
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關(guān)于EcoRI的部分酶切
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我準(zhǔn)備用EcoRI+XbaI在我的質(zhì)粒上克隆外源基因，但酶切驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒上有兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)，所以不得不進(jìn)行部分酶切。 我的計(jì)劃是：先用XbaI進(jìn)行完全酶切，然后加少量EcoRI，進(jìn)行部分酶切（希望出現(xiàn)只在一個(gè)EcoRI位點(diǎn)切開的條帶），然后回收在我希望的位點(diǎn)切開的那條帶，進(jìn)行克隆。 我已經(jīng)嘗試了一次，發(fā)現(xiàn)即使只酶切5分鐘，質(zhì)粒上的兩個(gè)EcoRI都全切開了。大家有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)嗎？ |
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我以前做過類似的部分酶切實(shí)驗(yàn)： 我得經(jīng)驗(yàn)如下： 首先必須精確計(jì)算所需的酶量。我曾經(jīng)在小木蟲推薦過一個(gè)軟件（Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ�。洌澹螅椋纾睿澹颍�，你可以利用該軟件精確計(jì)算出ＥｃｏＲＩ的用量，然后將其理論用量減少１／２或２／３，將酶切時(shí)間縮短到５分鐘，應(yīng)該沒問題。。（注意，酶一定先稀釋１０倍以上，然后從稀釋的酶樣品中取出所需的酶量，否則，由于原酶中含５０％甘油，誤差太大，肯定效果不好）。 如果這種克隆都能成功，你可以藐視大部分的分子克隆工作。 祝一切順利。 |
10樓2012-03-18 15:23:09
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8樓2012-03-18 08:54:42
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