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dhd997榮譽(yù)版主 (文壇精英)
自由人，我型我秀！
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[交流]
分子生物版之電泳專(zhuān)題-重金獎(jiǎng)勵(lì) 已有45人參與
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我們學(xué)生物的會(huì)遇到很多電泳的問(wèn)題，瓊脂糖，SDS-PAGE等等。 開(kāi)本帖的目的就是希望蟲(chóng)友們能把遇到的各種電泳，電泳試驗(yàn)方案，試驗(yàn)中遇到的問(wèn)題以及解決方案，小經(jīng)驗(yàn)，小總結(jié)分享出來(lái)。達(dá)到資源共享。 講訴范圍不限，只要是關(guān)于電泳的，電泳液，pH，電壓，膠的制備等等各個(gè)方面都可以。最好是自己親身經(jīng)歷的。 獎(jiǎng)勵(lì)措施：只要合理獎(jiǎng)勵(lì)5-50金幣，EPI不等。 電泳試驗(yàn)方案列出一般獎(jiǎng)勵(lì)不多，方案一般都統(tǒng)一化了。對(duì)于試驗(yàn)中遇到的問(wèn)題以及解決方案，小經(jīng)驗(yàn)，小總結(jié)的分享，會(huì)重金獎(jiǎng)勵(lì)  歡迎大家積極參與。本活動(dòng)的目的：當(dāng)蟲(chóng)友遇到電泳問(wèn)題的時(shí)候，希望只要看這一個(gè)帖子就可以解決問(wèn)題。 [ Last edited by dhd997 on 2011-8-28 at 09:59 ] |
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2樓2011-08-21 13:20:48
wanhscn
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dhd997(金幣+5): 說(shuō)的對(duì)啊 2011-09-05 18:36:02
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dhd997(金幣+5): 說(shuō)的對(duì)啊 2011-09-05 18:36:02
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大家在做電泳之前，不要逮到一個(gè)protocol，不管三七二十一，蒙頭就做。 可以先參考常用的比較經(jīng)典的protocol，如《分析克隆實(shí)驗(yàn)指南》上不但實(shí)驗(yàn)步驟過(guò)程連怎么配試劑都有，建立自己的最初的技術(shù)，然后遇到問(wèn)題時(shí)，再參考別人的（師兄，師姐以及論壇上）經(jīng)驗(yàn)，不斷完善自己的技術(shù)。 |
30樓2011-09-05 14:54:54
zhangxn2010
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dhd997(金幣+10): 有意思 2011-09-17 09:18:57
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dhd997(金幣+10): 有意思 2011-09-17 09:18:57
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關(guān)于電泳液我有個(gè)自己的經(jīng)驗(yàn)，或者可以稱(chēng)為教訓(xùn)。 我們實(shí)驗(yàn)室一直用1*TAE做電泳液，有次冰乙酸沒(méi)有了，臨時(shí)決定用TBE做電泳緩沖液。我接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)是要切膠回收的，用的國(guó)產(chǎn)tiangen試劑盒，后面的兩個(gè)月我一直在重復(fù)回收連接，怎么連也連不到載體上。 后來(lái)逐個(gè)排除，原來(lái)問(wèn)題出在了TBE上面，硼酸可以和DNA結(jié)合，不利于后續(xù)連接反應(yīng)（至少對(duì)國(guó)產(chǎn)膠回收試劑盒是如此）。 希望我白白浪費(fèi)兩個(gè)月時(shí)間的教訓(xùn)能給大家以啟發(fā)。 |
50樓2011-09-17 09:14:58
1949stone
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dhd997(金幣+20, MolEPI+1): 第一個(gè)參與者，重金獎(jiǎng)勵(lì)。 2011-08-21 13:44:08
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Electrophoresis in Practice A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations Fourth [ Last edited by 1949stone on 2011-8-21 at 13:44 ] |
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fdfbox3樓2011-08-21 13:21:32
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dhd997(金幣+1): 來(lái)點(diǎn)實(shí)在的。不嫌說(shuō)的多 2011-08-21 16:39:46
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dhd997(金幣+1): 來(lái)點(diǎn)實(shí)在的。不嫌說(shuō)的多 2011-08-21 16:39:46
| 好帖，必須頂。。。 |
4樓2011-08-21 16:27:47
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amisking(金幣+3, MolEPI+1): good！ 2011-08-21 19:46:02
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amisking(金幣+3, MolEPI+1): good！ 2011-08-21 19:46:02
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同學(xué)分享給我 我再次分享 準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽 注意DNA酶污染的儀器可能會(huì)降解DNA，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。 選擇電泳方法 一般的核酸檢測(cè)只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個(gè)bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。 正確選擇凝膠濃度 對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2％之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。 適合的電泳緩沖液 常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。 電泳的合適電壓和溫度 電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過(guò)20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。 DNA樣品的純度和狀態(tài) 注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的NA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。 DNA的上樣 正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。 Marker的選擇 DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對(duì)照DNA來(lái)估計(jì)DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)才比較準(zhǔn)確。TIANGEN公司的DNA Marker條帶清晰，亮度均勻，質(zhì)量穩(wěn)定，是您實(shí)驗(yàn)的首選。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號(hào)弱等現(xiàn)象。 凝膠的染色和觀察 實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，雖然毒性小，但價(jià)格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性?xún)r(jià)比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。 [ Last edited by 1949stone on 2011-8-21 at 16:51 ] |
5樓2011-08-21 16:48:21
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amisking(金幣+2): 繼續(xù)！ 2011-08-21 19:46:09
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amisking(金幣+2): 繼續(xù)！ 2011-08-21 19:46:09
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說(shuō)實(shí)在的，其實(shí)電泳這個(gè)東西一般的問(wèn)題及其解決辦法網(wǎng)上一般都會(huì)有總結(jié)好的，其實(shí)大家都可以G一下的； 但是實(shí)際上呢，大家跑電泳的時(shí)候問(wèn)題就很多了，膠的濃度，電壓和時(shí)間的設(shè)置，以及電泳儀的工作狀態(tài)等等等。。。 總之呢，具體問(wèn)題具體分析。。。。 個(gè)人看法。。。 |
6樓2011-08-21 17:09:58
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dhd997: 分享一下經(jīng)驗(yàn)？ 2011-08-24 08:19:00
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8樓2011-08-23 20:01:39
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9樓2011-08-23 22:15:36
dhd997: 經(jīng)驗(yàn)？ 2011-08-24 08:19:41
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10樓2011-08-23 22:31:59
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