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這是張單酶切的電泳圖。我原來(lái)的質(zhì)粒大小是5700bp左右，預(yù)計(jì)插入一個(gè)817bp的片段。連接轉(zhuǎn)化后挑了六個(gè)單菌落，其中有三個(gè)菌液PCR有預(yù)期結(jié)果。然后我就提質(zhì)粒單酶切。結(jié)果竟然都有兩三個(gè)條帶，不知道問(wèn)題出在哪？而且從條帶位置上看，中間一個(gè)條帶的位置是我預(yù)期的6500多bp。求大家?guī)兔Ψ治鱿隆?br />

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1樓 2011-03-28 10:44:04

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zhangxn2010

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liuwei78(金幣+3): 2011-03-29 09:11:34

能把Maker大小說(shuō)一下嗎？

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2樓2011-03-28 13:12:12

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liuwei78(金幣+3): 2011-03-29 09:11:41

可能是你酶切時(shí)間短，切不完全導(dǎo)致的吧，6500是你的目的片段，下面的是沒(méi)有切開(kāi)的質(zhì)粒，跑得比較快，個(gè)人看法，僅供參考。

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3樓2011-03-28 15:20:03

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另一個(gè)天堂

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liuwei78(金幣+3): 2011-03-29 09:09:18

是不是酶切時(shí)間過(guò)短了，你可以參考一下

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4樓2011-03-28 15:23:52

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天使托

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liuwei78(金幣+3): 2011-03-29 09:09:07

單酶切驗(yàn)證，你確定你的質(zhì)粒和插入片段上只有一個(gè)此酶切位點(diǎn)嗎？我看有三個(gè)，不然怎么會(huì)切出來(lái)三條帶呢？
一般做酶切驗(yàn)證是這樣子的，把重組質(zhì)粒用你當(dāng)初的兩個(gè)酶進(jìn)行酶切，然后跑電泳時(shí)點(diǎn)上對(duì)照（原來(lái)酶切的質(zhì)粒+原來(lái)酶切的基因）。

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5樓2011-03-28 15:37:43

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河外生命

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dhd997(金幣+2): 謝謝交流 2011-03-29 08:43:19
liuwei78(金幣+3): 2011-03-29 09:07:53

酶切多長(zhǎng)時(shí)間，是否產(chǎn)生了環(huán)狀，線性，缺刻三種形式的DNA

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6樓2011-03-28 21:46:51

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Originally posted by 河外生命 at 2011-03-28 21:46:51:
酶切多長(zhǎng)時(shí)間，是否產(chǎn)生了環(huán)狀，線性，缺刻三種形式的DNA

我酶切了十三個(gè)小時(shí)左右，提質(zhì)粒電泳之后的確有三種形式的DNA，其中環(huán)狀最多。

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7樓2011-03-29 09:07:10

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Originally posted by 另一個(gè)天堂 at 2011-03-28 15:23:52:
是不是酶切時(shí)間過(guò)短了，你可以參考一下

我切了十三個(gè)多小時(shí)。

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8樓2011-03-29 09:07:39

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Originally posted by 天使托 at 2011-03-28 15:37:43:
單酶切驗(yàn)證，你確定你的質(zhì)粒和插入片段上只有一個(gè)此酶切位點(diǎn)嗎？我看有三個(gè)，不然怎么會(huì)切出來(lái)三條帶呢？
一般做酶切驗(yàn)證是這樣子的，把重組質(zhì)粒用你當(dāng)初的兩個(gè)酶進(jìn)行酶切，然后跑電泳時(shí)點(diǎn)上對(duì)照（原來(lái)酶切的質(zhì)粒 ...

我用的是當(dāng)初那個(gè)酶酶切的，理論上其他位置上沒(méi)有這個(gè)酶切位點(diǎn)。

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9樓2011-03-29 09:08:52

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Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-28 13:12:12:
能把Maker大小說(shuō)一下嗎？

19329,7743,6223,4254.。。。

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10樓2011-03-29 09:11:11

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liuwei78(金幣+5): 2011-03-30 09:43:26

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Originally posted by liuwei78 at 2011-03-29 09:07:10:
我酶切了十三個(gè)小時(shí)左右，提質(zhì)粒電泳之后的確有三種形式的DNA，其中環(huán)狀最多。

那估計(jì)是質(zhì)粒純度問(wèn)題，我也遇到過(guò)這種情況。是不是在純化過(guò)程中沒(méi)純化干凈？

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11樓2011-03-29 22:07:20

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傻子

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酶切不完全吧，不知道其他蟲(chóng)子的酶切如何，我自己做的確實(shí)沒(méi)切完全過(guò)，都帶有質(zhì)粒條帶，這樣的話，就首先包括質(zhì)粒條帶——這里可能包括1-3條帶，此外，是酶切后的條帶——不定，如需確定條帶，你首先需要在酶切前，仔細(xì)核對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的序列，是否在這些片段中只有單個(gè)酶切位點(diǎn)，然后做出預(yù)測(cè)。這通過(guò)DNAMAN這類(lèi)可以分析下。然后，多重復(fù)幾次吧

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12樓2011-03-31 10:31:45

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