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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 關于EcoRI的部分酶切
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酶切專家金蟲 (小有名氣)
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[求助]
關于EcoRI的部分酶切
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我準備用EcoRI+XbaI在我的質粒上克隆外源基因，但酶切驗證時發(fā)現在質粒上有兩個EcoRI位點，所以不得不進行部分酶切。 我的計劃是：先用XbaI進行完全酶切，然后加少量EcoRI，進行部分酶切（希望出現只在一個EcoRI位點切開的條帶），然后回收在我希望的位點切開的那條帶，進行克隆。 我已經嘗試了一次，發(fā)現即使只酶切5分鐘，質粒上的兩個EcoRI都全切開了。大家有相關經驗嗎？ |
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【答案】應助回帖
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 根據樓主反饋，切實可行，授予EPI！ 2012-03-20 11:44:26
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我以前做過類似的部分酶切實驗： 我得經驗如下： 首先必須精確計算所需的酶量。我曾經在小木蟲推薦過一個軟件（Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ�。洌澹螅椋纾睿澹颍�，你可以利用該軟件精確計算出ＥｃｏＲＩ的用量，然后將其理論用量減少１／２或２／３，將酶切時間縮短到５分鐘，應該沒問題。。（注意，酶一定先稀釋１０倍以上，然后從稀釋的酶樣品中取出所需的酶量，否則，由于原酶中含５０％甘油，誤差太大，肯定效果不好）。 如果這種克隆都能成功，你可以藐視大部分的分子克隆工作。 祝一切順利。 |
10樓2012-03-18 15:23:09
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