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summermio新蟲 (初入文壇)
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關(guān)于雙酶切后回收的問題
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各位大神 我最近在做原核表達(dá)。我的蛋白編碼基因大小大約只有300bp，用帶酶切位點(diǎn)的引物p出來后連19T載體測序正確。然后用Bam HI和Hind III這兩種酶切3小時(shí)。但是酶切完每次跑電泳下來切下來的T載體的條帶特別亮，但是目的片段特別暗，幾條帶一起回收都回收不出來東西。實(shí)在很郁悶。是不是因?yàn)槲业哪康钠蜗鄬?duì)于T載體太小了？有什么辦法能解決么？ 或者我能不能直接從含T載體的大腸桿菌菌液里pcr出目的片段直接雙酶切？ 希望各位賜教哈 |
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9樓2013-05-27 17:39:12
【答案】應(yīng)助回帖
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summermio(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-29 19:12:37
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我跟你一樣，我跑的兩個(gè)片段切下一個(gè)310，一個(gè)259.連的是18T。一開始怎么都看不到，然后大量切才一點(diǎn)點(diǎn)，然后回收率低的想哭。浪費(fèi)時(shí)間啊。。你看，3ug就要切60ul上樣的時(shí)候就要大孔，這樣就要切多的膠。損失率高啊。 后來我思考了一個(gè)辦法，發(fā)現(xiàn)很好用。我是用PCR機(jī)酶切的，切完以后開PCR機(jī)蓋子，開pcr管蓋子，設(shè)定到70度，蒸它1個(gè)小時(shí)。然后體積就從60變成30了。然后你做3管這樣的，可以更狠一點(diǎn)，直接蒸到15ul一管。然后45ul用一個(gè)大孔跑。包你切到漂漂亮亮的。。 不過其實(shí)我用之前那種很多一起跑，最后膠回收的時(shí)候全部濃縮到一個(gè)管里面，30ul。出來的濃度有2ng/ul。也能跟5900bp的表達(dá)載體連接。 |
10樓2013-05-27 23:40:26
summermio
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-05-27 10:34:25
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-05-27 10:34:25
| 300bp的PCR出錯(cuò)的概率不大。但我認(rèn)為完全沒有必要再做PCR。酶切后電泳條帶不亮是因?yàn)槠涡�。你可以適當(dāng)增加酶切時(shí)的質(zhì)粒用量就可以了。你可以估算一下，切5μg質(zhì)粒，才能有大致0.5μg的目的片段出來。再加上切膠回收會(huì)有一些損失，最后的產(chǎn)率可想而知了。雖然連接需要的DNA量很少，但為了保證回收片段的濃度，我認(rèn)為你至少需要切5-10μg的質(zhì)粒。 |
4樓2013-05-26 15:05:35
Renavatio
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chyanqiu
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