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summermio新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于雙酶切后回收的問題
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各位大神 我最近在做原核表達(dá)。我的蛋白編碼基因大小大約只有300bp，用帶酶切位點(diǎn)的引物p出來后連19T載體測序正確。然后用Bam HI和Hind III這兩種酶切3小時。但是酶切完每次跑電泳下來切下來的T載體的條帶特別亮，但是目的片段特別暗，幾條帶一起回收都回收不出來東西。實(shí)在很郁悶。是不是因?yàn)槲业哪康钠蜗鄬τ赥載體太小了？有什么辦法能解決么？ 或者我能不能直接從含T載體的大腸桿菌菌液里pcr出目的片段直接雙酶切？ 希望各位賜教哈 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應(yīng)助 2013-05-27 10:34:25
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| 300bp的PCR出錯的概率不大。但我認(rèn)為完全沒有必要再做PCR。酶切后電泳條帶不亮是因?yàn)槠涡�。你可以適當(dāng)增加酶切時的質(zhì)粒用量就可以了。你可以估算一下，切5μg質(zhì)粒，才能有大致0.5μg的目的片段出來。再加上切膠回收會有一些損失，最后的產(chǎn)率可想而知了。雖然連接需要的DNA量很少，但為了保證回收片段的濃度，我認(rèn)為你至少需要切5-10μg的質(zhì)粒。 |
4樓2013-05-26 15:05:35
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