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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 關于雙酶切后回收的問題
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summermio新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關于雙酶切后回收的問題
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各位大神 我最近在做原核表達。我的蛋白編碼基因大小大約只有300bp，用帶酶切位點的引物p出來后連19T載體測序正確。然后用Bam HI和Hind III這兩種酶切3小時。但是酶切完每次跑電泳下來切下來的T載體的條帶特別亮，但是目的片段特別暗，幾條帶一起回收都回收不出來東西。實在很郁悶。是不是因為我的目的片段相對于T載體太小了？有什么辦法能解決么？ 或者我能不能直接從含T載體的大腸桿菌菌液里pcr出目的片段直接雙酶切？ 希望各位賜教哈 |
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9樓2013-05-27 17:39:12
【答案】應助回帖
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summermio(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應助！ 2013-05-29 19:12:37
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我跟你一樣，我跑的兩個片段切下一個310，一個259.連的是18T。一開始怎么都看不到，然后大量切才一點點，然后回收率低的想哭。浪費時間啊。。你看，3ug就要切60ul上樣的時候就要大孔，這樣就要切多的膠。損失率高啊。 后來我思考了一個辦法，發(fā)現(xiàn)很好用。我是用PCR機酶切的，切完以后開PCR機蓋子，開pcr管蓋子，設定到70度，蒸它1個小時。然后體積就從60變成30了。然后你做3管這樣的，可以更狠一點，直接蒸到15ul一管。然后45ul用一個大孔跑。包你切到漂漂亮亮的。。 不過其實我用之前那種很多一起跑，最后膠回收的時候全部濃縮到一個管里面，30ul。出來的濃度有2ng/ul。也能跟5900bp的表達載體連接。 |
10樓2013-05-27 23:40:26
summermio
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