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summermio新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于雙酶切后回收的問(wèn)題
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各位大神 我最近在做原核表達(dá)。我的蛋白編碼基因大小大約只有300bp，用帶酶切位點(diǎn)的引物p出來(lái)后連19T載體測(cè)序正確。然后用Bam HI和Hind III這兩種酶切3小時(shí)。但是酶切完每次跑電泳下來(lái)切下來(lái)的T載體的條帶特別亮，但是目的片段特別暗，幾條帶一起回收都回收不出來(lái)東西。實(shí)在很郁悶。是不是因?yàn)槲业哪康钠蜗鄬?duì)于T載體太小了？有什么辦法能解決么？ 或者我能不能直接從含T載體的大腸桿菌菌液里pcr出目的片段直接雙酶切？ 希望各位賜教哈 |
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bullfrog325
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| 樓主不要擔(dān)心條帶亮否的問(wèn)題， 這個(gè)亮度是和DNA長(zhǎng)度有關(guān)系的。 同樣數(shù)量的DNA分子， 長(zhǎng)度越大在膠里的亮度越亮。T4連接的時(shí)候關(guān)鍵的是分子數(shù)量而不是ng/ul, 樓主只要在乎你切質(zhì)粒的時(shí)候起始濃度是不是在一般范圍里面， 如果是的話(huà)你回收的片段就是夠數(shù)量的。 |
7樓2013-05-27 15:16:10
stevenshi021
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| 你當(dāng)然可以直接PCR擴(kuò)增，雖然那個(gè)可能會(huì)有引入突變的風(fēng)險(xiǎn)（當(dāng)然比較小）。至于亮度的問(wèn)題是因?yàn)槠錀l帶小，亮度是與DNA量成正比的。你的載體與小片段如果酶切完全，其亮度比例應(yīng)該是與其DNA長(zhǎng)度比例一致。 |
2樓2013-05-26 06:13:38
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3樓2013-05-26 08:32:08
cicelyzh
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-05-27 10:34:25
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| 300bp的PCR出錯(cuò)的概率不大。但我認(rèn)為完全沒(méi)有必要再做PCR。酶切后電泳條帶不亮是因?yàn)槠涡�。你可以適當(dāng)增加酶切時(shí)的質(zhì)粒用量就可以了。你可以估算一下，切5μg質(zhì)粒，才能有大致0.5μg的目的片段出來(lái)。再加上切膠回收會(huì)有一些損失，最后的產(chǎn)率可想而知了。雖然連接需要的DNA量很少，但為了保證回收片段的濃度，我認(rèn)為你至少需要切5-10μg的質(zhì)粒。 |
4樓2013-05-26 15:05:35
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