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sxxuan金蟲 (著名寫手)
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[求助]
小片段雙酶切求助，急急急
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最近在做小片段載體的構(gòu)建，目的片段只有60bp左右，已經(jīng)成功連接到pMD18-T中，需要雙酶切后連接到pET28a中，但是怎么切怎么連都是假陽性，怎么辦？ 附上雙酶切圖片，Takara 50bp的marker，感覺小片段好像被切散了，請大家?guī)兔鉀Q呀，都構(gòu)建了兩個星期了，老大催得緊亞歷山大呀！ 雙酶切體系 質(zhì)粒 30ul 酶 各1ul 10*buffer 5ul 100*BSA 0.5ul TE 12.5ul 37℃ 2h 割膠回收的最后一步30ul洗脫，連接 pET28a 1ul 小片段 7ul T4 ligase 1ul buffer 1ul |
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我之前也做過小片段 首先，酶切膠回收時候，用的試劑盒是那個呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是說少呢？如果量少，多P幾管效果會好點。 第二，載體上是否有你的酶切位點呢？一般酶的說明書上，會對小片段或者PCR產(chǎn)物有要求的。 第三，菌落PCR的引物，之前用的時候Tm與現(xiàn)在是否相同呢 希望對你有幫助 |
4樓2012-07-25 18:26:48
dshlove
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【答案】應(yīng)助回帖
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你先看看你的小片段中有沒有你的酶切位點，有的話，就得換酶了，還要看看你的酶，酶切反應(yīng)時間長了是不是有其他的酶切活性。 還有，假陽性你是怎么檢測的？提出質(zhì)粒雙酶切的？還是菌落PCR? 你的回收試劑盒是什么？最后一步洗脫是不是量太少了，一般至少得40ul，不然得率會很低。 希望能幫上。 |
2樓2012-07-25 16:51:46
sxxuan
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3樓2012-07-25 17:15:02
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酶切位點端，加了保護堿基了嗎？ 你要看看你的說明書中推薦的反應(yīng)體系，還有酶切效率。 我建議是不要菌落PCR，直接提質(zhì)粒，酶切后跑膠，不過你的片段好小，不知道能不能跑得出來。 生工試劑盒不是有個建議洗脫范圍嘛，我覺得你那體積還是小了點，個人看法啊。 你說的不能測序，我覺得可能是就沒有構(gòu)建好的質(zhì)粒，可能是連接過程出問題，而不是酶切過程的問題。 |
7樓2012-07-25 21:48:17
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