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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 小片段雙酶切求助，急急急
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sxxuan金蟲 (著名寫手)
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[求助]
小片段雙酶切求助，急急急
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最近在做小片段載體的構建，目的片段只有60bp左右，已經(jīng)成功連接到pMD18-T中，需要雙酶切后連接到pET28a中，但是怎么切怎么連都是假陽性，怎么辦？ 附上雙酶切圖片，Takara 50bp的marker，感覺小片段好像被切散了，請大家?guī)兔鉀Q呀，都構建了兩個星期了，老大催得緊亞歷山大呀！ 雙酶切體系 質(zhì)粒 30ul 酶 各1ul 10*buffer 5ul 100*BSA 0.5ul TE 12.5ul 37℃ 2h 割膠回收的最后一步30ul洗脫，連接 pET28a 1ul 小片段 7ul T4 ligase 1ul buffer 1ul |
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 【分子生物】EPI帖 |
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dshlove
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7樓2012-07-25 21:48:17
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2樓2012-07-25 16:51:46
sxxuan
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3樓2012-07-25 17:15:02
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
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sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-07-26 16:41:25
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sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-07-26 16:41:25
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我之前也做過小片段 首先，酶切膠回收時候，用的試劑盒是那個呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是說少呢？如果量少，多P幾管效果會好點。 第二，載體上是否有你的酶切位點呢？一般酶的說明書上，會對小片段或者PCR產(chǎn)物有要求的。 第三，菌落PCR的引物，之前用的時候Tm與現(xiàn)在是否相同呢 希望對你有幫助 |
4樓2012-07-25 18:26:48
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