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sxxuan金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
小片段雙酶切求助，急急急
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最近在做小片段載體的構(gòu)建，目的片段只有60bp左右，已經(jīng)成功連接到pMD18-T中，需要雙酶切后連接到pET28a中，但是怎么切怎么連都是假陽(yáng)性，怎么辦？ 附上雙酶切圖片，Takara 50bp的marker，感覺(jué)小片段好像被切散了，請(qǐng)大家?guī)兔鉀Q呀，都構(gòu)建了兩個(gè)星期了，老大催得緊亞歷山大呀！ 雙酶切體系 質(zhì)粒 30ul 酶 各1ul 10*buffer 5ul 100*BSA 0.5ul TE 12.5ul 37℃ 2h 割膠回收的最后一步30ul洗脫，連接 pET28a 1ul 小片段 7ul T4 ligase 1ul buffer 1ul |
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你先看看你的小片段中有沒(méi)有你的酶切位點(diǎn)，有的話，就得換酶了，還要看看你的酶，酶切反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)了是不是有其他的酶切活性。 還有，假陽(yáng)性你是怎么檢測(cè)的？提出質(zhì)粒雙酶切的？還是菌落PCR? 你的回收試劑盒是什么？最后一步洗脫是不是量太少了，一般至少得40ul，不然得率會(huì)很低。 希望能幫上。 |
2樓2012-07-25 16:51:46
sxxuan
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3樓2012-07-25 17:15:02
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sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-07-26 16:41:25
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我之前也做過(guò)小片段 首先，酶切膠回收時(shí)候，用的試劑盒是那個(gè)呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是說(shuō)少呢？如果量少，多P幾管效果會(huì)好點(diǎn)。 第二，載體上是否有你的酶切位點(diǎn)呢？一般酶的說(shuō)明書(shū)上，會(huì)對(duì)小片段或者PCR產(chǎn)物有要求的。 第三，菌落PCR的引物，之前用的時(shí)候Tm與現(xiàn)在是否相同呢 希望對(duì)你有幫助 |
4樓2012-07-25 18:26:48
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5樓2012-07-25 20:31:31
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6樓2012-07-25 21:12:01
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酶切位點(diǎn)端，加了保護(hù)堿基了嗎？ 你要看看你的說(shuō)明書(shū)中推薦的反應(yīng)體系，還有酶切效率。 我建議是不要菌落PCR，直接提質(zhì)粒，酶切后跑膠，不過(guò)你的片段好小，不知道能不能跑得出來(lái)。 生工試劑盒不是有個(gè)建議洗脫范圍嘛，我覺(jué)得你那體積還是小了點(diǎn)，個(gè)人看法啊。 你說(shuō)的不能測(cè)序，我覺(jué)得可能是就沒(méi)有構(gòu)建好的質(zhì)粒，可能是連接過(guò)程出問(wèn)題，而不是酶切過(guò)程的問(wèn)題。 |
7樓2012-07-25 21:48:17
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