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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 存檔舊帖 » 雙酶切問題，跪求指導啊
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雙酶切問題，跪求指導啊
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各位大牛，誰來幫幫我啊，我最近做雙酶切，目的片段500左右，連載pmd18-simple-t載體上，用的是NEB公司的not1和bamh1兩個酶進行酶切，測序序列正確，可是not1就是切不動，not1我已經(jīng)驗證過了好用，什么單切，過夜切,都試過了，我用的是20ul體系酶各加0.5,單切10ul,20ul都用過了，。。。神了啊 ，這種情況我改怎么辦啊 |
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sxxuan
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3樓2013-10-08 17:16:03
panda73
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【答案】應助回帖
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你說得不是很清楚。我的理解是： 你已經(jīng)將500bp的片段克隆至載體pmd-simple-t了，現(xiàn)在準備用NotI+BamHI將此500bp片段切下來（可能準備亞克�。浚�，問題出在雙酶切上，對吧？ 如果上述推測正確，那么我建議你先對你的質粒DNA進行定量，然后各取1ugDNA,分別用NotI或BamHI進行單酶切，看看此兩個酶切位點是否都能成功進行單切。（質粒成功進行單酶切后電泳的帶型與未酶切的質粒不一樣，電泳可以明顯分辨）。 然后再考慮雙酶切。 酶切時的兩種酶的具體用量，我建議你利用double digestion designer(http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php)進行計算，不要隨意估計，以確保完全酶切或者不會因酶量過多而出現(xiàn)酶的星活性。 |
2樓2013-10-08 16:55:27
leonaliu2013
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【答案】應助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-10-08 17:22:27
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| 你的描述不太清楚，你說Not1好用，指的是你用這個酶單切切的是你這個片段，還是只是為了驗證這個酶是否好用而切得其他帶有Not1酶切位點的片段。如果你切的是你自己的片段，那么單酶切能切開，雙酶切切不開，那么你要考慮你用的buffer和反應條件是否不適合Not1，但是如果你的意思是你只是單純的驗證了你的Not1好用，而用這個酶切不開你的片段，那么建議你只用Not1單酶切，如果切不開那么是引物合成的公司可能給你合成錯了酶切位點。我遇到過這種情況 |
4樓2013-10-08 17:17:41
5樓2013-10-08 17:19:47
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