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hbl215金蟲 (文壇精英)
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關(guān)于噬菌體展示技術(shù)的一些問題 已有4人參與
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最近在學(xué)習(xí)基因重組跟噬菌體展示技術(shù)這一塊，完全小白一枚，再看文獻(xiàn)中有幾個(gè)問題想請(qǐng)教： 1.從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，再設(shè)計(jì)帶有poly-C尾巴的anchor引物作為5’端引物擴(kuò)增抗體的可變區(qū)，這里的5’端引物是不是僅靠這些G-C配對(duì)就可以延伸呢，如果是的話至少需要多少堿基配對(duì)就可以保證延伸？ 2.3’端的基因特異性引物是以FR4為模板設(shè)計(jì)的么，還是其他的設(shè)計(jì)方案？或者3’端引物以恒定區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)，先擴(kuò)增出整個(gè)重輕鏈基因，再通過基因序列比對(duì)，除去一樣的恒定區(qū)序列，剩下的就是可變區(qū)序列？ 3.在噬菌體庫的富集篩選中，為什么富集到最后一輪，庫容量越來越大呢？我的理解是篩去原始庫中的一些不結(jié)合的噬菌體后，庫應(yīng)該越來越小呀，最后濃縮出高結(jié)合力的精華呀。 希望做過的懂得的幫我解釋一下，小白不勝感激！ |
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6樓2014-06-26 09:29:58
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關(guān)于5‘引物，一般是用leader 或者FR1的保守序列來設(shè)計(jì)兼并引物使用。不知道你所說的polyC具體是指什么？mRNA帽子結(jié)構(gòu)？ 3’端引物，通常做FAB庫，會(huì)將恒定區(qū)CH1/CK的末端來作為引物使用。對(duì)于scFv庫，可以CH1/CK的恒定區(qū)起始端做一擴(kuò)引物，再用FR4作為二擴(kuò)引物，當(dāng)然也可以用FR4序列直接做引物來擴(kuò)增。 和CDR的定義不同，恒定區(qū)序列已經(jīng)有了嚴(yán)格的定義，你可以找文獻(xiàn)或IMGT看看。 富集篩選，顧名思義當(dāng)然是越來越富集了：） 前面已經(jīng)有人提過了，你可以理解為：篩選剩下的克隆被特異性富集，此時(shí)的庫容只代表富集的程度，而非抗體多樣性了。 看你介紹，應(yīng)該是做鼠抗，現(xiàn)在應(yīng)經(jīng)有很多現(xiàn)成的引物集可以用，你可以查查文獻(xiàn)。這里推薦一篇經(jīng)典的 Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regions from any immunoglobulin gene family 另外，你是本科還是碩士，這種應(yīng)用性很強(qiáng)的課題最好有師兄師姐帶著做，會(huì)快捷很多。 |
7樓2014-06-26 14:39:38
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