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hbl215金蟲 (文壇精英)
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[求助]
關于噬菌體展示技術的一些問題 已有4人參與
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最近在學習基因重組跟噬菌體展示技術這一塊，完全小白一枚，再看文獻中有幾個問題想請教： 1.從雜交瘤細胞中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，再設計帶有poly-C尾巴的anchor引物作為5’端引物擴增抗體的可變區(qū)，這里的5’端引物是不是僅靠這些G-C配對就可以延伸呢，如果是的話至少需要多少堿基配對就可以保證延伸？ 2.3’端的基因特異性引物是以FR4為模板設計的么，還是其他的設計方案？或者3’端引物以恒定區(qū)序列為模板設計，先擴增出整個重輕鏈基因，再通過基因序列比對，除去一樣的恒定區(qū)序列，剩下的就是可變區(qū)序列？ 3.在噬菌體庫的富集篩選中，為什么富集到最后一輪，庫容量越來越大呢？我的理解是篩去原始庫中的一些不結(jié)合的噬菌體后，庫應該越來越小呀，最后濃縮出高結(jié)合力的精華呀。 希望做過的懂得的幫我解釋一下，小白不勝感激！ |
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whui
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【答案】應助回帖
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hbl215: 金幣+50, ★★★很有幫助 2014-06-27 09:31:34
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關于5‘引物，一般是用leader 或者FR1的保守序列來設計兼并引物使用。不知道你所說的polyC具體是指什么？mRNA帽子結(jié)構(gòu)？ 3’端引物，通常做FAB庫，會將恒定區(qū)CH1/CK的末端來作為引物使用。對于scFv庫，可以CH1/CK的恒定區(qū)起始端做一擴引物，再用FR4作為二擴引物，當然也可以用FR4序列直接做引物來擴增。 和CDR的定義不同，恒定區(qū)序列已經(jīng)有了嚴格的定義，你可以找文獻或IMGT看看。 富集篩選，顧名思義當然是越來越富集了：） 前面已經(jīng)有人提過了，你可以理解為：篩選剩下的克隆被特異性富集，此時的庫容只代表富集的程度，而非抗體多樣性了。 看你介紹，應該是做鼠抗，現(xiàn)在應經(jīng)有很多現(xiàn)成的引物集可以用，你可以查查文獻。這里推薦一篇經(jīng)典的 Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regions from any immunoglobulin gene family 另外，你是本科還是碩士，這種應用性很強的課題最好有師兄師姐帶著做，會快捷很多。 |
7樓2014-06-26 14:39:38
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9樓2014-06-27 09:42:09
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