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三爺111金蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于BMDM-骨髓來源的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)。 已有2人參與
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最近在用骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，沖出骨髓-過篩網(wǎng)-裂紅之后將細(xì)胞放在大培養(yǎng)皿里讓其貼壁2h后，取上清放到新的培養(yǎng)皿里加1640完全培養(yǎng)基和50ng/ml的M-CSF培養(yǎng)6天，中間半量換液兩次。但養(yǎng)出來的細(xì)胞在20倍鏡下觀察胞內(nèi)有空泡，不知道是怎么會(huì)事，是細(xì)胞本身就是這樣還是細(xì)胞因子的用量太大呢？求高人指教��！ R3CKDF[`}]OK{Z{@QG3[0T2.jpg |
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 巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn) |
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我一直在養(yǎng)BMDM 圖中的細(xì)胞一看就是培養(yǎng)的時(shí)間太久了，cell confluence 太低，這樣已經(jīng)不好用了。 我們用100ng/mL M-CSF 在 RPMI-1640（5% Pen/Step, 10% FBS)里培養(yǎng)。 第一天算Day0，Day3天添加培養(yǎng)基100ng/mL M-CSF（不換RPMI） 第五天confluence在80%-90% 就可以使用了。 跑過FACS 這時(shí)候97%的貼壁細(xì)胞都是F4/80+CD11b+ 第三天的時(shí)候是80%左右。 到第七天有99%以上的細(xì)胞都是F4/80+CD11b+,但是這時(shí)候細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)下降的很厲害了。 |
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三爺11116樓2016-03-22 01:28:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
三爺111: 金幣+4, ★★★很有幫助 2014-09-16 09:41:50
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我們實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)BMDM是這樣誘導(dǎo)的： 1、引頸處死小鼠，將小鼠后肢的皮毛剝置足部，連同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中 2、鑷子夾住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨 3、 用2mL注射器吸取無血清的1640培養(yǎng)基，將針頭刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓至骨髓變白，將骨髓沖洗液加入到50mL離心管中，1000rpm離心5min 4、將離心得到的骨髓細(xì)胞用10mL含MCSF（50ng/mL）和血清的1640培養(yǎng)基重懸，然后分裝到兩個(gè)25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃和5%CO2氣體濃度適度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天 5、棄上清，換5mL含MCSF（50ng/mL）和血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天 |
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6樓2014-09-15 16:40:01
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我們實(shí)驗(yàn)室沒有2h-4h之后棄掉貼壁的細(xì)胞，收集上清里的細(xì)胞這一步。我下室才半年，這是師兄們所用的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的方法。是兩條腿的分成了兩瓶（你也可以試一下分三瓶，因?yàn)槲矣X得分兩瓶其實(shí)密度也挺大的，分三瓶應(yīng)該也沒問題）。誘導(dǎo)好的細(xì)胞形態(tài)還好，但是必須盡快用，如果超過十幾天形態(tài)就會(huì)變圓。另外，陽性率我沒有測過，我的師兄他們之前曾經(jīng)測過，說是只要誘導(dǎo)成功的差不多都是，所以后來誘導(dǎo)時(shí)就沒再測過。 |
8樓2014-09-22 12:37:30
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17樓2016-03-22 15:12:27
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2樓2014-07-01 13:21:01
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3樓2014-07-01 15:12:46
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5樓2014-07-04 14:29:39
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