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richard0820銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
崩潰！！易錯(cuò)pcr重組質(zhì)粒構(gòu)建總是失敗�。∏蟠笊裰笇�(dǎo)！ 已有3人參與
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小蟲做的是酶的定向進(jìn)化，主要是采用易錯(cuò)pcr技術(shù)實(shí)施目的片段的隨機(jī)突變，完了插入表達(dá)載體，表達(dá)蛋白測(cè)定性質(zhì)。 目前在構(gòu)建重組載體階段，可是構(gòu)建了一個(gè)月了就是不成功，老板又在催，心里那個(gè)急��！具體情況是這樣的- 載體是我們實(shí)驗(yàn)室事先構(gòu)建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易錯(cuò)pcr把目的片段p出來，主要是通過改變pcr體系中的各組分比例和濃度，然后純化，在和同樣的載體經(jīng)過雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化。具體的體系: 雙酶切 用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，這兩種酶在同一緩沖液中活性不同，xhol在最適Nhel緩沖液中最大活性只有50％，我通過加倍用量進(jìn)行酶切，體系是1ug樣品加0.5ulNhel 1ulXhol，酶切5h，經(jīng)過單雙酶切驗(yàn)證，載體是切完全了的。 連接 用的是takara的t4連接酶，體系是按照說明書來的，16 度過夜 酶切后都是經(jīng)過膠回收的，回收后濃度有50+ 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)的DH 設(shè)置了感受態(tài)空白對(duì)照，經(jīng)酶切膠回收后不加連接酶的空載，和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化全部連接液25ul，操作沒問題，以前做正常質(zhì)粒都是成功的，結(jié)果是感受態(tài)長(zhǎng)得好，空載不長(zhǎng)，連接產(chǎn)物有時(shí)長(zhǎng)很多單克隆，有時(shí)就一兩個(gè)，經(jīng)菌落pcr驗(yàn)證全是假陽(yáng)性，每個(gè)板挑了10個(gè)克隆。菌落pcr技術(shù)沒問題。 問題: 空載沒長(zhǎng)，說明幾乎沒有載體自連，實(shí)驗(yàn)板長(zhǎng)了有兩種情況:1 連接成功，那菌落pcr應(yīng)有條帶 2 連接不成功，載體又沒有自連，那哪來的克��？？ 好吧，就算不考慮空載對(duì)照，就算酶切不徹底，出現(xiàn)單酶切，載體自連了，但是我的載體本身是含有正常目的片段的啊，那應(yīng)該p的出來�。�？盡管沒有插入我需要的錯(cuò)誤片段。 為啥又出現(xiàn)克隆，又p不出條帶呢？？？整不明白？ 求各位大神指導(dǎo)哇，感激不盡�。�！ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] [ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ] |
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richard0820(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-30 19:23:05
richard0820(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-30 19:23:05
| 有點(diǎn)不明白你說的“結(jié)果是感受態(tài)長(zhǎng)得好，空載不長(zhǎng)，連接產(chǎn)物有時(shí)長(zhǎng)很多單克隆，有時(shí)就一兩個(gè)”，意思是說感受態(tài)空白對(duì)照長(zhǎng)了，加切膠回收但不連接的沒長(zhǎng)，然后加鏈接產(chǎn)物長(zhǎng)得時(shí)好時(shí)壞？我猜想是不是你的板子的抗性出了問題，并且使用的感受態(tài)細(xì)胞液有問題。有重復(fù)過試驗(yàn)嗎？每次i都是這樣？ |
2樓2014-08-10 13:59:55
3樓2014-10-30 17:07:29
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