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richard0820銅蟲 (初入文壇)
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崩潰��！易錯pcr重組質(zhì)粒構(gòu)建總是失敗�。∏蟠笊裰笇�(dǎo)！ 已有3人參與
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小蟲做的是酶的定向進(jìn)化，主要是采用易錯pcr技術(shù)實施目的片段的隨機突變，完了插入表達(dá)載體，表達(dá)蛋白測定性質(zhì)。 目前在構(gòu)建重組載體階段，可是構(gòu)建了一個月了就是不成功，老板又在催，心里那個急��！具體情況是這樣的- 載體是我們實驗室事先構(gòu)建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易錯pcr把目的片段p出來，主要是通過改變pcr體系中的各組分比例和濃度，然后純化，在和同樣的載體經(jīng)過雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化。具體的體系: 雙酶切 用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，這兩種酶在同一緩沖液中活性不同，xhol在最適Nhel緩沖液中最大活性只有50％，我通過加倍用量進(jìn)行酶切，體系是1ug樣品加0.5ulNhel 1ulXhol，酶切5h，經(jīng)過單雙酶切驗證，載體是切完全了的。 連接 用的是takara的t4連接酶，體系是按照說明書來的，16 度過夜 酶切后都是經(jīng)過膠回收的，回收后濃度有50+ 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)的DH 設(shè)置了感受態(tài)空白對照，經(jīng)酶切膠回收后不加連接酶的空載，和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化全部連接液25ul，操作沒問題，以前做正常質(zhì)粒都是成功的，結(jié)果是感受態(tài)長得好，空載不長，連接產(chǎn)物有時長很多單克隆，有時就一兩個，經(jīng)菌落pcr驗證全是假陽性，每個板挑了10個克隆。菌落pcr技術(shù)沒問題。 問題: 空載沒長，說明幾乎沒有載體自連，實驗板長了有兩種情況:1 連接成功，那菌落pcr應(yīng)有條帶 2 連接不成功，載體又沒有自連，那哪來的克��？？ 好吧，就算不考慮空載對照，就算酶切不徹底，出現(xiàn)單酶切，載體自連了，但是我的載體本身是含有正常目的片段的啊，那應(yīng)該p的出來��？？盡管沒有插入我需要的錯誤片段。 為啥又出現(xiàn)克隆，又p不出條帶呢？？？整不明白？ 求各位大神指導(dǎo)哇，感激不盡�。�！ [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] [ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ] |
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