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tiankong1991新蟲 (初入文壇)
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[求助]
戊二醛法合成抗原中的還原問題 已有1人參與
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各位蟲友，本人在做戊二醛合成抗原的實驗，遇到一些問題，已經(jīng)僵持了兩個多月了，所以特來論壇請教各位。問題如下： 本人用戊二醛作交聯(lián)劑，因為市售的戊二醛濃度表示“50% in water”，沒有寫是什么濃度，查看了下帖子，都說按質(zhì)量分?jǐn)?shù)算，大概算了下，文獻(xiàn)里提到的20mM的濃度差不多是稀釋250倍，所以我稀釋之后使用的濃度是0.2%，添加量是1ml。我用的蛋白是20mg 的BSA，半抗原是含氨基的螯合劑（氨基的摩爾數(shù)是1.5*10-5mol）。操作是先將金屬和螯合劑反應(yīng)一段時間，然后加戊二醛過夜，第二天加到蛋白溶液里攪拌24h 。最后加硼氫化鈉還原。 1：把半抗原反應(yīng)液加到蛋白溶液里的時候，體系出現(xiàn)渾濁。首先說明，滴加的速度已經(jīng)比較慢了，差不多200ul都要滴加一兩分鐘了。是因為戊二醛的量多了嗎？還是什么原因？第一次做的時候因為沉淀太多，蛋白條帶也跑不出來。 2：戊二醛反應(yīng)是不是每次的結(jié)果都不一樣呢？做了好幾次，結(jié)果紫外結(jié)果顯示都有一定的差異。 3：戊二醛反應(yīng)最后生成希夫堿之后，是不是需要加還原劑還原？我用的是硼氫化鈉，但是因為螯合劑上有羧基，不知道會不會被還原？而且，想問下各位蟲友，硼氫化鈉和希夫堿反應(yīng)的比例應(yīng)該是多少呢？我看到有文獻(xiàn)提到10mg/ml，所以我用了40mg，但是氣泡產(chǎn)生的非常多，而且原本體系中的渾濁也變澄清了，顏色也從黃色變成了別的顏色。是因為ph改變了的關(guān)系讓沉淀重新溶解了嗎？ 因為本人化學(xué)方面確實不精通，所以不甚了解。希望各位蟲友多發(fā)意見，謝謝大家�。� |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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tiankong1991: 金幣+5, ★★★很有幫助, 真是太囧了，新手上路，金幣不多，非常感謝您 2014-07-08 10:59:51
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戊二醛必定會引起蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)，你一般不要使用戊二醛把半抗原連接到BSA等連接蛋白質(zhì)上，形成完全抗原，這樣一般地會有各種連接蛋白分子之間的交聯(lián)，而形成空間位阻，遮蔽和完全占據(jù)抗原免疫簇。半抗原連接到BSA等連接蛋白質(zhì)上，形成完全抗原時，抗原免疫簇由半抗原小分子和連接蛋白質(zhì)共同構(gòu)成，不是有半抗原小分子完全地決定完全抗原的免疫反應(yīng)性，換言之，同樣的半抗原小分子連接與不同的連接蛋白質(zhì)，免疫實驗動物后，在體外培養(yǎng)融合篩選得到的單克隆抗體也可能是不同的。半抗原是含氨基，連接蛋白質(zhì)必有游離羧基，你用碳二亞胺很容易在室溫下就完成共建鏈接形成完全抗原，碳二亞胺是零臂連接催化劑，不可能形成蛋白質(zhì)之間的分子交聯(lián)物，因為空間位阻的關(guān)系。 樓主需要了解更多Bioconjugation，可以參考：“確定蛋白質(zhì)—多肽相互作用結(jié)合位點的實驗設(shè)計：凌波麗個人總結(jié)之二 ”，下載：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank文中有Bioconjugation的常見方法舉例說明。 |
2樓2014-07-08 10:17:58
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3樓2014-07-08 10:56:37
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| 補充一下：用EDC的話，只要半抗原與BSA摩爾數(shù)比在10:1到50:1就差不多了，半抗原的量可以更大，另外，反應(yīng)溶液就用水，用不著調(diào)成酸性，EDC催化活性很強，一般可以在0-4度的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)，時間過一夜即可。然后用質(zhì)譜檢測鏈接效果。作為課題稍微擴展：可以在確定半抗原——BSA形成的完全抗原與抗體的具體結(jié)合位點的解析。樓主可以參考：“確定蛋白質(zhì)—多肽相互作用結(jié)合位點的實驗設(shè)計：凌波麗個人總結(jié)之二 ”，下載：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank，具體的實驗流程，此文已經(jīng)完整給出。 |
5樓2014-07-09 00:31:28
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