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qinglongwang新蟲 (小有名氣)
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[交流]
測得序列基因已導入大腸桿菌，為什么誘導后產生的蛋白與所求蛋白不一致？ 已有4人參與
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| 測得序列基因已導入大腸桿菌，為什么誘導后，電泳得到蛋白與所求蛋白不一致？是誘導方法不對？ |
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4.樓主誘導大腸桿菌表達的蛋白質不是導入的目的基因的蛋白質產物，至少樓主提取到的所謂的目的基因的蛋白質產物實際上是別的蛋白質。 5.樓主導入大腸桿菌的目的基因可能沒有以正確 的 ORF 表達，僅僅測定DNA序列不能保證一段基因片段的啟動子和終止子就一定是目的基因以正確的ORF 表達時該有的位點，很可能發(fā)生了ORF 改變，至少是啟動子和終止子，這樣的改變可能發(fā)生在轉錄水平和翻譯水平上。僅僅是基因序列導入了載體，不能保證基因序列在轉錄和翻譯時不發(fā)生改變。 |
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qinglongwang7樓2014-07-24 03:01:31
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如果表達的蛋白質的一級結構的確沒有改變，而電泳顯示的蛋白質的相對分子量大于基因表達預測大小不一樣，你是用SDS PAGE electrophoresis 測定的蛋白質的分子量的吧？不是用Native PAGE electrophoresis測定的蛋白質的分子量的吧？用Native PAGE electrophoresis也能夠測定的蛋白質的分子量，但是事情可就多了�？赡苡腥N原因： 1.有可能是SDS PAGE electrophoresis操作有問題，出現了“鬼帶”。 “鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 2.預測ORF 的生物信息學軟件預測不完全準確，這是很正常的事情。無論是DNAstar，還是Genescan，還是其他任何預測基因的軟件的預測都不可能完全準確。 3.樓主的目的蛋白質是在大腸菌中構成融合蛋白質表達，而樓主用生物信息學預測目的基因時沒有加上融合片段的氨基酸序列。 解決辦法：用MS測定目的蛋白質的分子量，并且用基于Edman降解法的自動測序儀對于蛋白質測定序列，很容易確定。 |
6樓2014-07-24 02:52:29
qinglongwang
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9樓2014-07-24 08:41:38
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