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qinglongwang新蟲(chóng) (小有名氣)
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測(cè)得序列基因已導(dǎo)入大腸桿菌，為什么誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白與所求蛋白不一致？ 已有4人參與
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| 測(cè)得序列基因已導(dǎo)入大腸桿菌，為什么誘導(dǎo)后，電泳得到蛋白與所求蛋白不一致？是誘導(dǎo)方法不對(duì)？ |
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4.樓主誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)不是導(dǎo)入的目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，至少樓主提取到的所謂的目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物實(shí)際上是別的蛋白質(zhì)。 5.樓主導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因可能沒(méi)有以正確 的 ORF 表達(dá)，僅僅測(cè)定DNA序列不能保證一段基因片段的啟動(dòng)子和終止子就一定是目的基因以正確的ORF 表達(dá)時(shí)該有的位點(diǎn)，很可能發(fā)生了ORF 改變，至少是啟動(dòng)子和終止子，這樣的改變可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上。僅僅是基因序列導(dǎo)入了載體，不能保證基因序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)不發(fā)生改變。 |
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qinglongwang7樓2014-07-24 03:01:31
qinglongwang
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3樓2014-07-23 21:52:56
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4樓2014-07-23 22:43:26
qinglongwang
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如果表達(dá)的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的確沒(méi)有改變，而電泳顯示的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量大于基因表達(dá)預(yù)測(cè)大小不一樣，你是用SDS PAGE electrophoresis 測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量的吧？不是用Native PAGE electrophoresis測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量的吧？用Native PAGE electrophoresis也能夠測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量，但是事情可就多了�？赡苡腥N原因： 1.有可能是SDS PAGE electrophoresis操作有問(wèn)題，出現(xiàn)了“鬼帶”。 “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。 2.預(yù)測(cè)ORF 的生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)不完全準(zhǔn)確，這是很正常的事情。無(wú)論是DNAstar，還是Genescan，還是其他任何預(yù)測(cè)基因的軟件的預(yù)測(cè)都不可能完全準(zhǔn)確。 3.樓主的目的蛋白質(zhì)是在大腸菌中構(gòu)成融合蛋白質(zhì)表達(dá)，而樓主用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)目的基因時(shí)沒(méi)有加上融合片段的氨基酸序列。 解決辦法：用MS測(cè)定目的蛋白質(zhì)的分子量，并且用基于Edman降解法的自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)于蛋白質(zhì)測(cè)定序列，很容易確定。 |
6樓2014-07-24 02:52:29
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10樓2014-07-24 08:46:47
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