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Changhua1989新蟲 (初入文壇)
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[求助]
表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)——染色質(zhì)免疫沉淀相關(guān)問題？ 已有2人參與
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本人之前是做微生物分子生態(tài)學(xué)的，最近由于工作需要，在學(xué)習(xí)表觀遺傳學(xué)，以前做學(xué)生沒好好學(xué)分子生物學(xué)，現(xiàn)在看遺傳這方面真是云里霧里的， 其中關(guān)于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)部分，一直搞不懂，它的研究目的是體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用，問幾個(gè)問題：1. 這里的蛋白質(zhì)，是不是就只是指組蛋白？ 2. DNA從組蛋白分開來不是拿去測序了嗎？這時(shí)組蛋白作什么用？怎么研究它們間的關(guān)系？ 3. 實(shí)驗(yàn)中用抗原抗體的方法進(jìn)行沉淀，這里的抗體是針對組蛋白設(shè)計(jì)的嗎？ 4. 組蛋白不是都一樣嗎？難道不同基因的組蛋白不同？ 5. DNA拿去測序，也不能了解其甲基化情況吧？那測序到底什么用處？ 問的問題很幼稚，還請學(xué)霸們耐心解答！非常感謝！ |
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ssssllllnnnn 
至尊木蟲 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2015-01-11 18:53:04
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2015-01-11 18:53:04
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那要對B基因的調(diào)控順序進(jìn)行分析預(yù)測，看上面有哪些可能的response elements，也就是可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或反應(yīng)元件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證步驟基本包括： 1、構(gòu)建由B基因調(diào)控序列（啟動(dòng)子+增強(qiáng)子順序）調(diào)控的報(bào)告基因，用此進(jìn)行transient transfection luciferase assay（向細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染該報(bào)告基因和可能的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體），看所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是否對該報(bào)告基因有調(diào)控作用； 2、如果1有預(yù)期的結(jié)果，則進(jìn)一步對可能的response elements進(jìn)行突變，再按1的方法重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，目的是驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對B的調(diào)節(jié)作用確系由所推定的response elements介導(dǎo)。 3、在上述基礎(chǔ)上，檢測轉(zhuǎn)錄因子A對內(nèi)源性B基因的表達(dá)調(diào)控，兩個(gè)方面：一是向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子A，看B基因的表達(dá)（mRNA和蛋白）；另一方面，用siRNA knockdown轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)，再看B基因的表達(dá)。 4、可以用ChIP assay驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子A確是與內(nèi)源性B基因之調(diào)控序列結(jié)合。 5、其他功能意義上的進(jìn)一步研究。 希望有幫助，并祝順利！ |
10樓2015-01-11 02:04:13
蜂鳥404
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-27 19:19:41
Changhua1989: 金幣+1, ★有幫助 2014-07-28 09:11:55
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Changhua1989: 金幣+1, ★有幫助 2014-07-28 09:11:55
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不止是組蛋白吧，組蛋白是否一樣我不知道，但還有一種叫轉(zhuǎn)錄因子的蛋白也能和DNA相互作用從而直接或間接調(diào)控基因的表達(dá)，一般研究轉(zhuǎn)錄因子就要研究它調(diào)控的基因，和它具體和DNA哪一段序列結(jié)合，這是做免疫共沉淀后對DNA測序就有必要了 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-07-27 11:32:59
Changhua1989
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3樓2014-07-27 14:25:20
蜂鳥404
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4樓2014-07-27 14:42:31
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