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Changhua1989新蟲 (初入文壇)
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表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)——染色質(zhì)免疫沉淀相關(guān)問題？ 已有2人參與
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本人之前是做微生物分子生態(tài)學(xué)的，最近由于工作需要，在學(xué)習(xí)表觀遺傳學(xué)，以前做學(xué)生沒好好學(xué)分子生物學(xué)，現(xiàn)在看遺傳這方面真是云里霧里的， 其中關(guān)于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)部分，一直搞不懂，它的研究目的是體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用，問幾個(gè)問題：1. 這里的蛋白質(zhì)，是不是就只是指組蛋白？ 2. DNA從組蛋白分開來不是拿去測序了嗎？這時(shí)組蛋白作什么用？怎么研究它們間的關(guān)系？ 3. 實(shí)驗(yàn)中用抗原抗體的方法進(jìn)行沉淀，這里的抗體是針對(duì)組蛋白設(shè)計(jì)的嗎？ 4. 組蛋白不是都一樣嗎？難道不同基因的組蛋白不同？ 5. DNA拿去測序，也不能了解其甲基化情況吧？那測序到底什么用處？ 問的問題很幼稚，還請學(xué)霸們耐心解答！非常感謝！ |
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有關(guān)ChIP的問題已經(jīng)有朋友問起。在另一個(gè)帖子中我做了具體的回答，建議樓主到這個(gè)帖子去可以下： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7701737&pid=8#pid8 以下是我剛剛進(jìn)一步回答的一個(gè)問題，希望對(duì)上述幾位同道有幫助： ChIP的主要用途是確定DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）是否與基因的某部位結(jié)合。以轉(zhuǎn)錄因子A舉例說明： 轉(zhuǎn)錄因子A一定有許多受其調(diào)節(jié)的靶基因，假定你懷疑B基因可能是轉(zhuǎn)錄因子A的靶基因，那么你要回答的問題首先是A對(duì)B在轉(zhuǎn)錄水平上有直接調(diào)節(jié)作用；然后是回答A是否與B的調(diào)控區(qū)域（增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域）結(jié)合，只有結(jié)合了才會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)B調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因相互作用一般都通過一段concensus順序，即所謂的response elements實(shí)現(xiàn)的，所以在回答此問題之前，要對(duì)靶基因B的調(diào)控區(qū)進(jìn)行分析，看有無轉(zhuǎn)錄因子A的可能結(jié)合順序，一般可能不只一個(gè)，如果有這樣的順序，就更加支持B是A的靶基因的判斷。接下來就要具體研究A與B調(diào)控區(qū)域的結(jié)合情況，此時(shí)就用的ChIP assay. 具體說，用A的抗體進(jìn)行IP，然后用B調(diào)控區(qū)中含有A結(jié)合的response elements附近的上下游引物對(duì)沉淀物中的DNA進(jìn)行PCR。如果有產(chǎn)物就證實(shí)A與B的調(diào)控區(qū)結(jié)合。當(dāng)然需要有對(duì)照，對(duì)照可以采用距離response elements有一段距離的上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。理論上對(duì)照引物是不該有擴(kuò)增產(chǎn)物的。到此為止，就把所要回答的問題回答了。當(dāng)然，嚴(yán)格說來，實(shí)驗(yàn)還沒有結(jié)束，還應(yīng)該用B調(diào)控區(qū)域做一個(gè)reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection觀察轉(zhuǎn)錄因子A對(duì)B基因調(diào)控區(qū)所控制的報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)情況，具體說，如果所用response elements是野生型，則該reporter會(huì)受A的調(diào)控，若是突變型，則不再手A的調(diào)控。至此，整個(gè)問題算是大致完整解決了。 除了主要上述應(yīng)用之外，偶爾也可以用于尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。仍以上述轉(zhuǎn)錄因子A為例，為了尋找A的靶基因，可以用A的抗體做IP，然后將所獲得的DNA片段進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測定，最后按照A的concensus response elements進(jìn)行分析所得到的諸多克隆是否含有A的結(jié)合位點(diǎn)而篩出A的可能靶基因（調(diào)控區(qū)）。這部分也許是你所理解的內(nèi)容？ |
6樓2014-07-28 03:23:28
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那要對(duì)B基因的調(diào)控順序進(jìn)行分析預(yù)測，看上面有哪些可能的response elements，也就是可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或反應(yīng)元件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證步驟基本包括： 1、構(gòu)建由B基因調(diào)控序列（啟動(dòng)子+增強(qiáng)子順序）調(diào)控的報(bào)告基因，用此進(jìn)行transient transfection luciferase assay（向細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染該報(bào)告基因和可能的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體），看所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是否對(duì)該報(bào)告基因有調(diào)控作用； 2、如果1有預(yù)期的結(jié)果，則進(jìn)一步對(duì)可能的response elements進(jìn)行突變，再按1的方法重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，目的是驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對(duì)B的調(diào)節(jié)作用確系由所推定的response elements介導(dǎo)。 3、在上述基礎(chǔ)上，檢測轉(zhuǎn)錄因子A對(duì)內(nèi)源性B基因的表達(dá)調(diào)控，兩個(gè)方面：一是向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子A，看B基因的表達(dá)（mRNA和蛋白）；另一方面，用siRNA knockdown轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)，再看B基因的表達(dá)。 4、可以用ChIP assay驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子A確是與內(nèi)源性B基因之調(diào)控序列結(jié)合。 5、其他功能意義上的進(jìn)一步研究。 希望有幫助，并祝順利！ |
10樓2015-01-11 02:04:13
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4樓2014-07-27 14:42:31
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不止是組蛋白吧，組蛋白是否一樣我不知道，但還有一種叫轉(zhuǎn)錄因子的蛋白也能和DNA相互作用從而直接或間接調(diào)控基因的表達(dá)，一般研究轉(zhuǎn)錄因子就要研究它調(diào)控的基因，和它具體和DNA哪一段序列結(jié)合，這是做免疫共沉淀后對(duì)DNA測序就有必要了 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-07-27 11:32:59
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9樓2015-01-09 17:14:23
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