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Changhua1989新蟲 (初入文壇)
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[求助]
表觀遺傳學實驗——染色質(zhì)免疫沉淀相關問題？ 已有2人參與
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本人之前是做微生物分子生態(tài)學的，最近由于工作需要，在學習表觀遺傳學，以前做學生沒好好學分子生物學，現(xiàn)在看遺傳這方面真是云里霧里的， 其中關于染色質(zhì)免疫沉淀實驗部分，一直搞不懂，它的研究目的是體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用，問幾個問題：1. 這里的蛋白質(zhì)，是不是就只是指組蛋白？ 2. DNA從組蛋白分開來不是拿去測序了嗎？這時組蛋白作什么用？怎么研究它們間的關系？ 3. 實驗中用抗原抗體的方法進行沉淀，這里的抗體是針對組蛋白設計的嗎？ 4. 組蛋白不是都一樣嗎？難道不同基因的組蛋白不同？ 5. DNA拿去測序，也不能了解其甲基化情況吧？那測序到底什么用處？ 問的問題很幼稚，還請學霸們耐心解答！非常感謝！ |
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至尊木蟲 (知名作家)
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【答案】應助回帖
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Changhua1989: 金幣+4, ★★★很有幫助 2014-07-28 09:12:49
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有關ChIP的問題已經(jīng)有朋友問起。在另一個帖子中我做了具體的回答，建議樓主到這個帖子去可以下： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7701737&pid=8#pid8 以下是我剛剛進一步回答的一個問題，希望對上述幾位同道有幫助： ChIP的主要用途是確定DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）是否與基因的某部位結(jié)合。以轉(zhuǎn)錄因子A舉例說明： 轉(zhuǎn)錄因子A一定有許多受其調(diào)節(jié)的靶基因，假定你懷疑B基因可能是轉(zhuǎn)錄因子A的靶基因，那么你要回答的問題首先是A對B在轉(zhuǎn)錄水平上有直接調(diào)節(jié)作用；然后是回答A是否與B的調(diào)控區(qū)域（增強子/啟動子區(qū)域）結(jié)合，只有結(jié)合了才會在轉(zhuǎn)錄水平上對B調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因相互作用一般都通過一段concensus順序，即所謂的response elements實現(xiàn)的，所以在回答此問題之前，要對靶基因B的調(diào)控區(qū)進行分析，看有無轉(zhuǎn)錄因子A的可能結(jié)合順序，一般可能不只一個，如果有這樣的順序，就更加支持B是A的靶基因的判斷。接下來就要具體研究A與B調(diào)控區(qū)域的結(jié)合情況，此時就用的ChIP assay. 具體說，用A的抗體進行IP，然后用B調(diào)控區(qū)中含有A結(jié)合的response elements附近的上下游引物對沉淀物中的DNA進行PCR。如果有產(chǎn)物就證實A與B的調(diào)控區(qū)結(jié)合。當然需要有對照，對照可以采用距離response elements有一段距離的上下游引物進行擴增。理論上對照引物是不該有擴增產(chǎn)物的。到此為止，就把所要回答的問題回答了。當然，嚴格說來，實驗還沒有結(jié)束，還應該用B調(diào)控區(qū)域做一個reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection觀察轉(zhuǎn)錄因子A對B基因調(diào)控區(qū)所控制的報告基因表達的誘導情況，具體說，如果所用response elements是野生型，則該reporter會受A的調(diào)控，若是突變型，則不再手A的調(diào)控。至此，整個問題算是大致完整解決了。 除了主要上述應用之外，偶爾也可以用于尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。仍以上述轉(zhuǎn)錄因子A為例，為了尋找A的靶基因，可以用A的抗體做IP，然后將所獲得的DNA片段進行克隆，并進行序列測定，最后按照A的concensus response elements進行分析所得到的諸多克隆是否含有A的結(jié)合位點而篩出A的可能靶基因（調(diào)控區(qū)）。這部分也許是你所理解的內(nèi)容？ |
6樓2014-07-28 03:23:28
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2樓2014-07-27 11:32:59
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3樓2014-07-27 14:25:20
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4樓2014-07-27 14:42:31
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