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博克儂浮碼銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
克隆問(wèn)題 已有6人參與
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| 想請(qǐng)教前輩們一個(gè)問(wèn)題，就是克隆的時(shí)候用的是單酶切，質(zhì)粒和目的片段都用同一種酶切開，連接也連接上了，但是卻怎么都不表達(dá)，請(qǐng)問(wèn)有沒有可能是連接后目的片段的復(fù)制方向和質(zhì)粒的復(fù)制方向相反，也就是目的片段的啟動(dòng)子和質(zhì)粒復(fù)制時(shí)的啟動(dòng)子方向相反導(dǎo)致不表達(dá)，如果真是這種情況，該怎樣做才能讓他們的啟動(dòng)子方向一致，請(qǐng)前輩們多多賜教 |
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2樓2014-07-28 10:46:55
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3樓2014-07-28 11:48:46
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4樓2014-07-28 14:37:01
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5樓2014-07-28 15:02:27
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6樓2014-07-28 16:09:17
【答案】應(yīng)助回帖
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自然是有可能。你可以用定向PCR來(lái)試一下，不用浪費(fèi)測(cè)序的錢，而且也很迅速。最好是在涂板之后挑多個(gè)單菌落做，如果已經(jīng)提了質(zhì)粒，也可以用質(zhì)粒做模板。當(dāng)然要多測(cè)幾個(gè)，因?yàn)槔碚撋线B接正確的概率是50%，考慮載體自連的話正確率要比這個(gè)低得多。 做PCR的引物組合有兩種：1. 載體上游引物+目的基因下游引物；2. 目的基因上游引物+載體下游引物。 這樣子，只有當(dāng)你基因片段的閱讀順序和載體同向才可以得到PCR產(chǎn)物，反向的話就無(wú)法擴(kuò)增。之后把能擴(kuò)增的提質(zhì)粒送去測(cè)序吧，不測(cè)序?qū)嵲谑遣豢孔V的。 |
7樓2014-07-28 19:42:51
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8樓2014-07-30 10:38:53
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