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電泳結(jié)果如此讓人淚奔，下一步該如何做呢？ 已有7人參與
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這是做的濃度梯度，me2+濃度梯度，還有引物濃度梯度，，結(jié)果還是如此，下一步怎么讓人做下去啊 jh 2014-08-01 15 小時(shí) 49 分鐘.jpg |
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看體系，沒啥大毛病，dNTP稍微有點(diǎn)兒高，4微終濃度1mM，一般終濃度0.2mM 左右�？梢栽囍档鸵稽c(diǎn)兒加1微左右試試，因?yàn)閐NTP濃度太高PCR也會(huì)出不來，mg2+的話 根據(jù)TOYOBO的建議終濃度在1.5mM，可以先做下dNTP降低濃度的，然后再試試降低mg，primer 差不多，就這樣，還有就是反應(yīng)條件了，退火溫度也可以做梯度，50-60，以前我做乙肝病毒DNA時(shí)做過這個(gè)范圍，再有循環(huán)數(shù)，30，35，40，或更高，都可以嘗試�；蛘�，你可以看看你們實(shí)驗(yàn)室其他人有沒有已經(jīng)擴(kuò)增出來的基因組，借過來用你的反應(yīng)條件看看能不能擴(kuò)出來，對(duì)比下，如果出來了，就是你基因組問題，如果沒出來，看看兩者反應(yīng)體系條件的區(qū)別再做調(diào)整。祝早日成功！ |
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夢(mèng)飄雪4樓2014-08-01 20:06:35
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| 我之前做的時(shí)候有時(shí)候也會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象，鎂離子和dNTP的濃度都稍微降一下，因?yàn)閐NTP濃度高的話容易出問題。引物10uM濃度，20uL體系一般各需要0.5uL就可以了，多了反而不好。提取出RNA后可以先跑一下電泳，看看是不是有三條條帶，也有可能是提取步驟出問題了。退火溫度可以改變一下，因?yàn)橄旅嬗械囊锒垠w有點(diǎn)多…… |
12樓2014-08-04 16:56:30
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| 用基因組為模板時(shí)，一般要將基因組稀釋20倍左右再擴(kuò)增，引物稀釋10倍就行了，rTaq 酶的話，一般50ul 體系，模板 1ul，引物各2ul ，其它按說明加，退火55，另外可嘗試下加 DMSO，減少非特異性。rTaq 酶保真性不高，易突變。 |
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