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小甜點(diǎn)fly鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
新人求助：DGGE電泳問題，條帶不夠清晰 已有2人參與
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新人做DGGE，求助~~~ DGGE電泳分析大腸菌群。提取糞便DNA，引物：GC-F338,R518，片段230bp，50μPCR體系：Mix25μ，引物1μ*2，DNA模板1μ（400ng）。PCR程序：94℃ 2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，*30次循環(huán)；72℃ 2min。退火溫度已經(jīng)做過梯度，57和58度較好，但瓊脂糖跑膠發(fā)現(xiàn)除230bp以外還有一50bp左右的雜帶，應(yīng)該是引物二聚體（溫度梯度下引物二聚體的量并沒有明顯改變）。 10%膠濃度，40%-75%變性梯度（垂直電泳變性區(qū)域40%-70%），一般30或40μl上樣，PCR產(chǎn)物：buffer=25：10。預(yù)電泳200V，20min-30min。電泳150V ，5h。 目前的主要問題:引物二聚體會(huì)不會(huì)影響DGGE效果？DGGE圖有的條帶都不是很清晰，不清晰分析也很成問題，正常應(yīng)該是一條細(xì)細(xì)的條帶，是PCR的問題還是膠有問題？還需要怎樣優(yōu)化？ 20140801 4樣品.jpg |
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