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wxy1234yyf金蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于體外轉(zhuǎn)錄 已有1人參與
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| 想用不含sigma因子的核心酶做體外轉(zhuǎn)錄，再另加入不同sigma因子來確定是哪種sigma因子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。如何優(yōu)化條件？我做了幾次全失敗，希望高人傳授一下經(jīng)驗。 |
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2樓2014-08-06 16:03:52
wxy1234yyf
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先把RNA核心酶（Epicenter）和sigma因子（已脫咪唑）孵育，37度10min，再加入以下試劑： 5xtranscription buffer (0.2M Tris-HCl,ph7.5; 0.75M KCl, 50mM MgCl2, 0.05% TritoonX-100) 5ul NTP(10mM) 0.5ul DIG-UTP: 0.5ul 50U RNase inhibitor: 0.5ul BSA(10mg/ml): 0.25ul 肝素鈉（12.5mg/ml）: 0.5ul DTT(0.2M): 0.25ul 加上500ng左右DNA模板，總體系25ul，37度反應(yīng)20min。 RNA膠電泳無條帶。 有些疑惑： 1. DNA模板是選用超螺旋質(zhì)粒DNA還是PCR純化的模板DNA 2. 查閱文獻發(fā)現(xiàn)不同作者選用不同試劑，例如HEPES，谷氨酸鉀，EDTA等等，不知對結(jié)果有什么影響 |
3樓2014-08-06 18:30:38
wxy1234yyf
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4樓2014-08-06 18:41:01
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5樓2014-08-12 08:45:39
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