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sakura01_22木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白質(zhì)相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測(cè)不出
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| 如題，在蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測(cè)，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時(shí)，檢測(cè)不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測(cè)不出，希望哪位蟲友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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凌波麗
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有人還是先去看看免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)的原理吧！免疫識(shí)別發(fā)生在細(xì)胞尚未裂解時(shí)�。。《笫强蛊渲幸粋�(gè)蛋白質(zhì)的單抗與其中一個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生免疫識(shí)別！這步能夠使蛋白質(zhì)變性嗎�。�？？變性了還免疫識(shí)別個(gè)鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。 ”The procedure for immunoprecipitation is outlined in Fig. 1. In the first step, cells are transfected with plasmids coding for a bait protein and its potential ligand, the target protein. These cells are lysed with a gentle detergenttreatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins. A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex. The antibody is then used as a handle to immobilize the proteins on inert Sepharose beads that are covalently coupled to Protein A, which stably binds the constant regions of many types of antibodies. At this point, those proteins not immobilized on beads are removed by a series of washes. Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338. |
18樓2014-08-20 12:39:57
dingchaoyue
木蟲 (著名寫手)
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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可否用pull-down的方法嚴(yán)重一下b是否可以拉下a？你的那種情況我們組里面有人也出現(xiàn)過那種情況，后來用純化蛋白用pull down方法解決的，而不是用抗體。當(dāng)然，還有可能那兩蛋白不互作，有a拉b的假陽性。 蛋白互作能否用bifc方法來試試？ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
至尊木蟲 (知名作家)
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:54
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這種情況雖然少見，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實(shí)性，具體說要有對(duì)照（同種屬的control IgG對(duì)照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實(shí)驗(yàn)，這時(shí)只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗(yàn)證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4樓2014-08-18 16:50:35
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