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sakura01_22木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白質相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測不出
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| 如題，在蛋白質相互作用研究中，IP檢測，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時，檢測不出。重復3遍左右，依然檢測不出，希望哪位蟲友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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【答案】應助回帖
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sakura01_22: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2014-08-19 10:35:21
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。現(xiàn)在多用精制的蛋白質A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的protein A（protein A是一種特定的蛋白質，不是泛指，protein A和protein A都能夠與抗體發(fā)生親和的相互作用）， 然后洗出beads—Protein A，就能連帶著吸附抗原達到精制的目的。這種研究方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定檢測一種特定蛋白質的新的作用搭檔。 原理部分是從從網上摘的，然后我根據(jù)樓主的問題的具體情況做了編輯（網上的帖子總是有錯！想偷懶都很難  ），沒有別的意思，就是我自己偷懶想打點字。  正如六樓的jurkat.1640說的“順便說一下你這個不叫pull-down”，樓主的方法就叫免疫共沉淀，與pull-down是兩種不同的方法。 言歸正傳，既然，樓主在5樓已經否認是假陽性，那么假陽性的問題就不討論了。 要解決:蛋白質相互作用研究中，IP檢測，蛋白X能拉下蛋白Y，但是蛋白Y IP蛋白X時，檢測不出。重復3遍左右，依然檢測不出 的問題，就要仔細對比兩次的免疫共沉淀的X和Y的具體反應條件有什么區(qū)別？(因為我的敘述中有抗體識別蛋白質protein A，所一把摟主的兩個蛋白質改稱為X和Y，以免混淆） 顯然，樓主兩次試驗的兩次的抗體分別是抗X的抗體和抗第Y的抗體，樓主的兩次試驗沒有同時成功，因為本實驗本身就有系統(tǒng)誤差，即假定：X與Y彼此發(fā)生非共價的相互作用時，彼此的抗原免疫簇都還是完好的，沒有空間位阻的。實際上果真如此嗎？不可能每一次都這樣幸運。 蛋白質-蛋白質相互作用的條件 蛋白質-蛋白質相互作用是一種分子識別過程，符合分子識別的一般原理。分子識別是通過兩種蛋白質分子各自的彼此對應的結合部位來實現(xiàn)的。要實現(xiàn)分子識別，就一般具備下列四個條件： 1）在兩種蛋白質分子的結合部位之間，其微區(qū)構象要能夠相嵌互補，造成相當大的接觸面積，或者經過構象變化達到這一目的。 2）兩個結合部位各有相應的化學基團，相互之間能產生足夠的結合力，使兩種蛋白質分子結合起來。 3）一般而言，多亞基的蛋白質解離后沒有生物功能，但是也有一些例外，比如G蛋白。 4）疏水相互作用是蛋白質-蛋白質聯(lián)系的主要作用力，相互作用區(qū)域主要有兩種結構---------疏水核（一般為β折疊）或者1到3 個疏水的氨基酸殘基團。 ————參考文獻： Bengt Nölting,Protein Folding Kinetics-Biophysical Methods，Springer, 2006,29-34, 162-164； 陶慰孫 等. 蛋白質分子基礎,高等教育出版社，1995,334； M.C.Lawrence, P.M.Colman. Shape Complentarity at Protein-protein Interface, J.Mol.Biol.1993,234:946-950 ； 分子識別的過程是通過兩種蛋白質分子各自的彼此對應的結合部位來實現(xiàn)的條件的第一條和第二條也同時是蛋白質-蛋白質相互作用的結果，蛋白質-蛋白質相互作用的結果至少還有一條：發(fā)生相互作用的蛋白質的分子表面空間必然受到另一個蛋白質的遮擋而產生空間位阻和一定程度上的重新折疊。 針對樓主的實驗： 如果蛋白質X和蛋白質Y發(fā)生了相互作用，而蛋白質X的分子表面的抗原免疫簇，既沒有受到空間位阻的遮擋，也沒有因為X可能發(fā)生了部分重折疊而改變了抗原免疫簇，那么用抗X蛋白質的抗體當然可以用免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，因為抗蛋白質X的抗體與蛋白質X順利的發(fā)生了免疫識別，而后抗蛋白質X的抗體又被beads—Protein A上的識別抗體的Protein A給粘上。 但是如果蛋白質X和蛋白質Y發(fā)生了相互作用，而蛋白質Y的分子表面的抗原免疫簇，受到空間位阻的遮擋，或者蛋白質Y的分子表面的抗原免疫簇干脆就在X與Y兩者的接觸面里，這時后加入細胞裂解液里的抗Y蛋白質的抗體上哪里去和蛋白質Y發(fā)生免疫識別（沒有抗原免疫簇或者難以接近抗原免疫簇），尤其是抗Y蛋白質的抗體是單克隆抗體時，其識別的抗原免疫簇是唯一的。做個不太恰當?shù)谋扔鳎盒∪m然有魅力，但是原配夫人在場時一般還是沒有可能上位的。 又或者Y在X相互作用過程中，Y可能發(fā)生了部分重折疊而改變了Y分子表面的抗原免疫簇，那么在第二種情況下，用抗Y蛋白質的抗體肯定無法免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，洗出來就是：抗Y蛋白質的抗體—Protein A—beads，沒有蛋白質X和蛋白質Y兩位主角的事情了，那實驗當然失敗了。 |
8樓2014-08-19 01:30:50
凌波麗
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵熱心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
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下面提供給樓主解決問題的方法： 蛋白質-蛋白質相互作用的方法有的是，最省事的就是直接用分子生物學軟件預測，再有：In Vivo Protein Cross-Linking,Mapping Protein-Ligand Interactions by hydroxyl-Radical Protein Footprinting,用MALDI-MS也可以，這些實驗都不費事。 請參考：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版）： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403 的第15章、第29章、第34章、第35章，還有使用各種光譜方法也行。 In Vivo Protein Cross-Linking還可以參考：GregT. Hermanson，Bioconjugate Techniques(2013,3rd edition) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6709686 另外，在下在論壇里發(fā)過兩篇蛋白質—多肽相互作用的長文，其研究方法也適用于 蛋白質-蛋白質相互作用，樓主可以參考。 1.確定蛋白質—多肽相互作用結合位點的實驗設計：凌波麗個人總結之二 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957 2.多 肽 受 體 研 究 咨 詢 與 回 復——凌波麗 個人總結 第五季 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7728986 |
9樓2014-08-19 01:55:36
dingchaoyue
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2樓2014-08-17 11:48:47
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這種情況雖然少見，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實性，具體說要有對照（同種屬的control IgG對照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實驗，這時只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4樓2014-08-18 16:50:35
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5樓2014-08-18 17:00:22
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