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sakura01_22木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白質(zhì)相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測(cè)不出
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| 如題，在蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測(cè)，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時(shí)，檢測(cè)不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測(cè)不出，希望哪位蟲友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 分子生物實(shí)驗(yàn)及蛋白純化結(jié)晶相關(guān)鏈接 | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
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下面提供給樓主解決問題的方法： 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法有的是，最省事的就是直接用分子生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)，再有：In Vivo Protein Cross-Linking,Mapping Protein-Ligand Interactions by hydroxyl-Radical Protein Footprinting,用MALDI-MS也可以，這些實(shí)驗(yàn)都不費(fèi)事。 請(qǐng)參考：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版）： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403 的第15章、第29章、第34章、第35章，還有使用各種光譜方法也行。 In Vivo Protein Cross-Linking還可以參考：GregT. Hermanson，Bioconjugate Techniques(2013,3rd edition) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6709686 另外，在下在論壇里發(fā)過兩篇蛋白質(zhì)—多肽相互作用的長(zhǎng)文，其研究方法也適用于 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，樓主可以參考。 1.確定蛋白質(zhì)—多肽相互作用結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：凌波麗個(gè)人總結(jié)之二 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957 2.多 肽 受 體 研 究 咨 詢 與 回 復(fù)——凌波麗 個(gè)人總結(jié) 第五季 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7728986 |
9樓2014-08-19 01:55:36
dingchaoyue
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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可否用pull-down的方法嚴(yán)重一下b是否可以拉下a？你的那種情況我們組里面有人也出現(xiàn)過那種情況，后來用純化蛋白用pull down方法解決的，而不是用抗體。當(dāng)然，還有可能那兩蛋白不互作，有a拉b的假陽性。 蛋白互作能否用bifc方法來試試？ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
至尊木蟲 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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sakura01_22(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:54
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這種情況雖然少見，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實(shí)性，具體說要有對(duì)照（同種屬的control IgG對(duì)照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實(shí)驗(yàn)，這時(shí)只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗(yàn)證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
木蟲 (小有名氣)
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4樓2014-08-18 16:50:35
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