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sakura01_22木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白質(zhì)相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測不出
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| 如題，在蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時(shí)，檢測不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測不出，希望哪位蟲友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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sakura01_22: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2014-08-19 10:35:21
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來�，F(xiàn)在多用精制的蛋白質(zhì)A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的protein A（protein A是一種特定的蛋白質(zhì)，不是泛指，protein A和protein A都能夠與抗體發(fā)生親和的相互作用）， 然后洗出beads—Protein A，就能連帶著吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種研究方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定檢測一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 原理部分是從從網(wǎng)上摘的，然后我根據(jù)樓主的問題的具體情況做了編輯（網(wǎng)上的帖子總是有錯(cuò)！想偷懶都很難  ），沒有別的意思，就是我自己偷懶想打點(diǎn)字。  正如六樓的jurkat.1640說的“順便說一下你這個(gè)不叫pull-down”，樓主的方法就叫免疫共沉淀，與pull-down是兩種不同的方法。 言歸正傳，既然，樓主在5樓已經(jīng)否認(rèn)是假陽性，那么假陽性的問題就不討論了。 要解決:蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測，蛋白X能拉下蛋白Y，但是蛋白Y IP蛋白X時(shí)，檢測不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測不出 的問題，就要仔細(xì)對比兩次的免疫共沉淀的X和Y的具體反應(yīng)條件有什么區(qū)別？(因?yàn)槲业臄⑹鲋杏锌贵w識(shí)別蛋白質(zhì)protein A，所一把摟主的兩個(gè)蛋白質(zhì)改稱為X和Y，以免混淆） 顯然，樓主兩次試驗(yàn)的兩次的抗體分別是抗X的抗體和抗第Y的抗體，樓主的兩次試驗(yàn)沒有同時(shí)成功，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)本身就有系統(tǒng)誤差，即假定：X與Y彼此發(fā)生非共價(jià)的相互作用時(shí)，彼此的抗原免疫簇都還是完好的，沒有空間位阻的。實(shí)際上果真如此嗎？不可能每一次都這樣幸運(yùn)。 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的條件 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是一種分子識(shí)別過程，符合分子識(shí)別的一般原理。分子識(shí)別是通過兩種蛋白質(zhì)分子各自的彼此對應(yīng)的結(jié)合部位來實(shí)現(xiàn)的。要實(shí)現(xiàn)分子識(shí)別，就一般具備下列四個(gè)條件： 1）在兩種蛋白質(zhì)分子的結(jié)合部位之間，其微區(qū)構(gòu)象要能夠相嵌互補(bǔ)，造成相當(dāng)大的接觸面積，或者經(jīng)過構(gòu)象變化達(dá)到這一目的。 2）兩個(gè)結(jié)合部位各有相應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，相互之間能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力，使兩種蛋白質(zhì)分子結(jié)合起來。 3）一般而言，多亞基的蛋白質(zhì)解離后沒有生物功能，但是也有一些例外，比如G蛋白。 4）疏水相互作用是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聯(lián)系的主要作用力，相互作用區(qū)域主要有兩種結(jié)構(gòu)---------疏水核（一般為β折疊）或者1到3 個(gè)疏水的氨基酸殘基團(tuán)。 ————參考文獻(xiàn)： Bengt Nölting,Protein Folding Kinetics-Biophysical Methods，Springer, 2006,29-34, 162-164； 陶慰孫 等. 蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ),高等教育出版社，1995,334； M.C.Lawrence, P.M.Colman. Shape Complentarity at Protein-protein Interface, J.Mol.Biol.1993,234:946-950 ； 分子識(shí)別的過程是通過兩種蛋白質(zhì)分子各自的彼此對應(yīng)的結(jié)合部位來實(shí)現(xiàn)的條件的第一條和第二條也同時(shí)是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果至少還有一條：發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)的分子表面空間必然受到另一個(gè)蛋白質(zhì)的遮擋而產(chǎn)生空間位阻和一定程度上的重新折疊。 針對樓主的實(shí)驗(yàn)： 如果蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y發(fā)生了相互作用，而蛋白質(zhì)X的分子表面的抗原免疫簇，既沒有受到空間位阻的遮擋，也沒有因?yàn)閄可能發(fā)生了部分重折疊而改變了抗原免疫簇，那么用抗X蛋白質(zhì)的抗體當(dāng)然可以用免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，因?yàn)榭沟鞍踪|(zhì)X的抗體與蛋白質(zhì)X順利的發(fā)生了免疫識(shí)別，而后抗蛋白質(zhì)X的抗體又被beads—Protein A上的識(shí)別抗體的Protein A給粘上。 但是如果蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y發(fā)生了相互作用，而蛋白質(zhì)Y的分子表面的抗原免疫簇，受到空間位阻的遮擋，或者蛋白質(zhì)Y的分子表面的抗原免疫簇干脆就在X與Y兩者的接觸面里，這時(shí)后加入細(xì)胞裂解液里的抗Y蛋白質(zhì)的抗體上哪里去和蛋白質(zhì)Y發(fā)生免疫識(shí)別（沒有抗原免疫簇或者難以接近抗原免疫簇），尤其是抗Y蛋白質(zhì)的抗體是單克隆抗體時(shí)，其識(shí)別的抗原免疫簇是唯一的。做個(gè)不太恰當(dāng)?shù)谋扔鳎盒∪m然有魅力，但是原配夫人在場時(shí)一般還是沒有可能上位的。 又或者Y在X相互作用過程中，Y可能發(fā)生了部分重折疊而改變了Y分子表面的抗原免疫簇，那么在第二種情況下，用抗Y蛋白質(zhì)的抗體肯定無法免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，洗出來就是：抗Y蛋白質(zhì)的抗體—Protein A—beads，沒有蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y兩位主角的事情了，那實(shí)驗(yàn)當(dāng)然失敗了。 |
8樓2014-08-19 01:30:50
dingchaoyue
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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可否用pull-down的方法嚴(yán)重一下b是否可以拉下a？你的那種情況我們組里面有人也出現(xiàn)過那種情況，后來用純化蛋白用pull down方法解決的，而不是用抗體。當(dāng)然，還有可能那兩蛋白不互作，有a拉b的假陽性。 蛋白互作能否用bifc方法來試試？ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:54
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這種情況雖然少見，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實(shí)性，具體說要有對照（同種屬的control IgG對照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實(shí)驗(yàn)，這時(shí)只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗(yàn)證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4樓2014-08-18 16:50:35
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