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sakura01_22木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
蛋白質(zhì)相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測(cè)不出
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| 如題，在蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測(cè)，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時(shí)，檢測(cè)不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測(cè)不出，希望哪位蟲(chóng)友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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凌波麗
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有人還是先去看看免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)的原理吧！免疫識(shí)別發(fā)生在細(xì)胞尚未裂解時(shí)�。�！而后裂解細(xì)胞，然后是抗其中一個(gè)蛋白質(zhì)的單抗與其中一個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生免疫識(shí)別！這步能夠使蛋白質(zhì)變性嗎�。�？？變性了還免疫識(shí)別個(gè)鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。 煮沸洗脫和WB與這些步驟重疊嗎？！還是煮沸洗脫和WB在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和免疫識(shí)別之前�。。�？ 圖1摘自：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，339. 圖1.JPG |
19樓2014-08-20 12:46:27
dingchaoyue
木蟲(chóng) (著名寫手)
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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可否用pull-down的方法嚴(yán)重一下b是否可以拉下a？你的那種情況我們組里面有人也出現(xiàn)過(guò)那種情況，后來(lái)用純化蛋白用pull down方法解決的，而不是用抗體。當(dāng)然，還有可能那兩蛋白不互作，有a拉b的假陽(yáng)性。 蛋白互作能否用bifc方法來(lái)試試？ [ 發(fā)自小木蟲(chóng)客戶端 ] |
2樓2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
至尊木蟲(chóng) (知名作家)
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:54
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這種情況雖然少見(jiàn)，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實(shí)性，具體說(shuō)要有對(duì)照（同種屬的control IgG對(duì)照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實(shí)驗(yàn)，這時(shí)只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗(yàn)證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4樓2014-08-18 16:50:35
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