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sakura01_22木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白質(zhì)相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之檢測不出
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| 如題，在蛋白質(zhì)相互作用研究中，IP檢測，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A時，檢測不出。重復(fù)3遍左右，依然檢測不出，希望哪位蟲友能幫忙解答一下。是否存在相互作用只能單方面pull-down的情況，這種情況如何解釋？ |
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凌波麗
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我再明確地說一下。最后的WB的檢測對象是由前面的免疫共沉淀形成的antibody–bait–target complex-protein A-beads在沸水和SDS處理下形成的需要檢測在細(xì)胞內(nèi)能夠相互作用的蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y，如果蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y在細(xì)胞中的確能夠發(fā)生非共價(jià)的相互作用的話，而且識別蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y兩者之一的抗體能夠在非變性條件下識別其抗原的話，也就是“A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex”，這樣antibody–bait–target complex中的抗體連接有bead的蛋白質(zhì)A識別并且非共價(jià)連接，這樣antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體才形成了，但是到目前為止，antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體和其他無關(guān)的蛋白質(zhì)都還是混合在細(xì)胞裂解液里。 直到這一步不可能使用劇烈的變性劑，雖然"these cells are lysed with a gentle detergent treatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins",但是細(xì)胞裂解不是一定要用gentle detergent treatment，用研磨、超聲波等也可以，不要太劇烈，也可以幾種細(xì)胞破碎方法并行。 既然antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體和其他無關(guān)的蛋白質(zhì)都還是混合在細(xì)胞裂解液里，怎么把他們提取出來？就用低溫離心即可，antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體比細(xì)胞裂解液中的其他蛋白質(zhì)和任何生物大分子及其復(fù)合體都要沉得多，所以一旦高速離心，首先會沉底。然后把沉底物上的上清液倒掉，獲得沉淀物。這樣免疫共沉淀這步才算是完成了，之前的基因構(gòu)建和表達(dá)（可能是異位表達(dá)）、細(xì)胞培養(yǎng)和收集細(xì)胞等當(dāng)然也要做，而且都在細(xì)胞裂解之前。 但是直到此時我們?nèi)匀徊恢赖蜏仉x心獲得的沉淀物究竟是antibody–bait–target complex-protein A-beads，還是僅僅是antibody-protein A-beads或者是antibody–bait-protein A-beads（就是說bait與target根本沒有發(fā)生相互作用），我們無從知曉，那怎么辦，這要用WB去檢測沉淀物被煮沸和SDS化中的蛋白質(zhì)成員中有沒有target，甚至好要檢測bait。 在樓主的試驗(yàn)中，如果被檢測可能發(fā)生相互作用的兩種蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y在細(xì)胞中的確發(fā)生了相互作用，而蛋白質(zhì)X的分子表面的抗原免疫簇，既沒有受到空間位阻的遮擋，也沒有因?yàn)閄可能發(fā)生了部分重折疊而改變了抗原免疫簇，那么用抗X蛋白質(zhì)的抗體當(dāng)然可以用免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，因?yàn)榭沟鞍踪|(zhì)X的抗體與蛋白質(zhì)X順利的發(fā)生了免疫識別，而后抗蛋白質(zhì)X的抗體又被beads—Protein A上的識別抗體的Protein A給粘上。 但是如果蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y發(fā)生了相互作用，而蛋白質(zhì)Y的分子表面的抗原免疫簇，受到空間位阻的遮擋，或者蛋白質(zhì)Y的分子表面的抗原免疫簇干脆就在X與Y兩者的接觸面里，這時后加入細(xì)胞裂解液里的抗Y蛋白質(zhì)的抗體上哪里去和蛋白質(zhì)Y發(fā)生免疫識別（沒有抗原免疫簇或者難以接近抗原免疫簇），尤其是抗Y蛋白質(zhì)的抗體是單克隆抗體時，其識別的抗原免疫簇是唯一的。做個不太恰當(dāng)?shù)谋扔鳎盒∪m然有魅力，但是原配夫人在場時一般還是沒有可能上位的。又或者Y在X相互作用過程中，Y可能發(fā)生了部分重折疊而改變了Y分子表面的抗原免疫簇，那么在第二種情況下，用抗Y蛋白質(zhì)的抗體肯定無法免疫共沉淀檢測出X-Y發(fā)生了相互作用，洗出來就是：抗Y蛋白質(zhì)的抗體—Protein A—beads，沒有蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y兩位主角的事情了，那實(shí)驗(yàn)當(dāng)然失敗了。那么也就是說：antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體根本不會形成！低溫離心獲得的沉淀物只是antibody-protein A-beads，后者被煮沸和SDS化出來只有antibody和protein A-beads，而WB的抗體時抗target（蛋白質(zhì)X或者蛋白質(zhì)Y）的序列抗原免疫簇的，因?yàn)槭鞘孪戎苽浜玫�，所以有target（蛋白質(zhì)X或者蛋白質(zhì)Y）存在就能夠用WB檢測出來。但是WB檢測的對象的免疫共沉淀物的成分（不然去檢測低溫離心沉淀時的上清液嗎？�。蝗粚�(shí)驗(yàn)還有意義嗎�。吭谏厦嫖艺f的情況中，就沒有antibody–bait–target complex-protein A-beads這個巨型分子復(fù)合體根本不會形成！難道棄去上清液收沉淀后，再用煮沸和SDS化居然能夠從antibody-protein A-beads沉淀物中變出target（蛋白質(zhì)X或者蛋白質(zhì)Y）�。考热蛔儾怀鰜�，WB檢測誰呀？難道去檢測空氣嗎？ |
23樓2014-08-21 11:26:32
dingchaoyue
木蟲 (著名寫手)
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:46
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可否用pull-down的方法嚴(yán)重一下b是否可以拉下a？你的那種情況我們組里面有人也出現(xiàn)過那種情況，后來用純化蛋白用pull down方法解決的，而不是用抗體。當(dāng)然，還有可能那兩蛋白不互作，有a拉b的假陽性。 蛋白互作能否用bifc方法來試試？ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
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sakura01_22: 金幣+2 2014-08-19 10:34:54
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這種情況雖然少見，但卻是可以出現(xiàn)的。具體到你的情況： 1、確證用A之抗體Co-IP B的真實(shí)性，具體說要有對照（同種屬的control IgG對照）。 2、另選一種或幾種B的抗體試一試。許多抗體并非適于IP實(shí)驗(yàn)，這時只能另選可能用的其他抗體。 3、用其他方法驗(yàn)證A-B間的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B間的相互作用。 Good luck！ |
3樓2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4樓2014-08-18 16:50:35
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