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jia901銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
T-RFLP分析之后，片段長(zhǎng)度為何會(huì)出現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，求解答 已有1人參與
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最近看一些文章T-RFLP的分析與克隆文庫(kù)一起做的，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的某條序列后面會(huì)列上RF的片段，如圖： 方法與圖例中均無(wú)清晰說(shuō)明，其中有的說(shuō)“Clones in bold indicated the dominant T-RFs detected by T-RFLP analysis.” 請(qǐng)了解的大俠能給普及一下，這種是怎么處理的，每條克隆所得序列怎么能與RF的長(zhǎng)度聯(lián)系起來(lái)。 謝過(guò)！ |
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2樓2014-09-23 13:38:51
peterrjp
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【答案】應(yīng)助回帖
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這個(gè)我以前也做過(guò)，也發(fā)過(guò)類(lèi)似的文章。T-RFLP的每個(gè)峰代表什么微生物，需要做克隆測(cè)序才知道。測(cè)序用的PCR引物和T-RFLP的最好完全一樣（只是不加熒光標(biāo)記），這樣就可以在ChromasPro等軟件上根據(jù)測(cè)序得到的序列預(yù)測(cè)T-RF片段理論長(zhǎng)度（即熒光標(biāo)記端與最近的酶切位點(diǎn)的距離）。這個(gè)理論長(zhǎng)度和T-RFLP實(shí)際做出來(lái)的長(zhǎng)度可能會(huì)有幾個(gè)bp的差距。如果你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果里有幾個(gè)長(zhǎng)度很接近的T-RF片段，就很難將它們與測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)上。這時(shí)就需要做克隆校正： 克隆測(cè)序時(shí)挑取的單克隆菌液可以直接用來(lái)當(dāng)作PCR的模版，PCR產(chǎn)物酶切純化后拿去做T-RFLP，這個(gè)T-RFLP圖譜理論上只有一個(gè)峰，它應(yīng)該和你之前做的T-RFLP n個(gè)峰中的某個(gè)峰的位置是一致的，這樣就能準(zhǔn)確地將測(cè)序序列和T-RF片段對(duì)應(yīng)上。 |
3樓2014-10-25 14:41:18
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