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jia901銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
T-RFLP分析之后，片段長度為何會出現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹中，求解答 已有1人參與
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最近看一些文章T-RFLP的分析與克隆文庫一起做的，在系統(tǒng)發(fā)育樹的某條序列后面會列上RF的片段，如圖： 方法與圖例中均無清晰說明，其中有的說“Clones in bold indicated the dominant T-RFs detected by T-RFLP analysis.” 請了解的大俠能給普及一下，這種是怎么處理的，每條克隆所得序列怎么能與RF的長度聯(lián)系起來。 謝過！ |
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tllcu
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2樓2014-09-23 13:38:51
peterrjp
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【答案】應(yīng)助回帖
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這個我以前也做過，也發(fā)過類似的文章。T-RFLP的每個峰代表什么微生物，需要做克隆測序才知道。測序用的PCR引物和T-RFLP的最好完全一樣（只是不加熒光標(biāo)記），這樣就可以在ChromasPro等軟件上根據(jù)測序得到的序列預(yù)測T-RF片段理論長度（即熒光標(biāo)記端與最近的酶切位點(diǎn)的距離）。這個理論長度和T-RFLP實際做出來的長度可能會有幾個bp的差距。如果你的實驗結(jié)果里有幾個長度很接近的T-RF片段，就很難將它們與測序結(jié)果對應(yīng)上。這時就需要做克隆校正： 克隆測序時挑取的單克隆菌液可以直接用來當(dāng)作PCR的模版，PCR產(chǎn)物酶切純化后拿去做T-RFLP，這個T-RFLP圖譜理論上只有一個峰，它應(yīng)該和你之前做的T-RFLP n個峰中的某個峰的位置是一致的，這樣就能準(zhǔn)確地將測序序列和T-RF片段對應(yīng)上。 |
3樓2014-10-25 14:41:18
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