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zsygxh金蟲 (小有名氣)
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[求助]
Bradford測蛋白濃度，稀釋樣品之間濃度誤差問題 已有1人參與
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| 我的樣品經(jīng)常會(huì)稀釋多次，比如稀釋10倍（10+90），再稀釋至20倍（50+50）、40倍，（用的是上樣buffer，或6M鹽酸胍），然后一起測濃度，盡管標(biāo)曲r^2基本都能達(dá)到0.990以上，但是濃度在0.1-0.5范圍內(nèi)的樣品濃度之間的倍數(shù)對(duì)應(yīng)不起來，比如稀釋20倍是0.366，而40倍卻是0.233，誤差較大，不知如何取舍。這種情況幾乎在每次都會(huì)發(fā)生，且往往是稀釋倍數(shù)越大，濃度越往上偏。懷疑過稀釋不均勻，于是最近混勻時(shí)除了輕輕吹打，我還會(huì)離心快甩并再次搖晃混勻，所以基本排除不均勻的可能性。也想過是蛋白稀釋時(shí)沉了，但后來用6M鹽酸胍稀釋（包涵體蛋白）也還是這樣。考慮過同把移液槍不同刻度間可能有誤差，所以采用上面50u+50u的比例稀釋，可問題還在�，F(xiàn)在，我實(shí)在想不出問題出在哪，而且每次測濃度我都特傷自尊，望有經(jīng)驗(yàn)的蟲蟲交流下。 |
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zeropoint555
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5樓2016-02-16 16:10:06
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不管何種方法測定蛋白濃度的準(zhǔn)確性都依賴于待測蛋白的濃度，只有在一定范圍內(nèi)才處在線性范圍內(nèi)，濃度太低或太高時(shí)，測定值都會(huì)有偏差。 我相信，你的情況是過度稀釋造成的，因?yàn)闈舛群艿�，讀數(shù)的任何輕微波動(dòng)都會(huì)造成較大偏差。例如，如果濃度較高，讀數(shù)可以從0.31波動(dòng)至0.33，偏差對(duì)最總濃度影響不大，如從6.2變?yōu)?.6mg/ml（假定系數(shù)為x20）。但是，如果濃度很低，讀數(shù)從0.07波動(dòng)至0.09，這一波動(dòng)對(duì)蛋白濃度的測到值卻很大，分別為0.14和0.18。雖然波動(dòng)差值都是0.02，前者引起的誤差約6%，而后者在高達(dá)30%左右！ 我的建議是，在較高蛋白濃度條件下測定蛋白，以此為準(zhǔn)進(jìn)行稀釋就可以了，不需要對(duì)稀釋后的蛋白再次測定。 |
2樓2014-08-24 09:53:34
zsygxh
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之所以測多組是因?yàn)榈鞍诐舛雀撸鶕?jù)電泳結(jié)果不太確定要稀釋幾倍，所以往往稀釋2組或3組，以確保有1-2組的濃度在0.1-0.5間。而最終，我通常也是取稀釋倍數(shù)小的那個(gè)值的，畢竟稀釋次數(shù)越多，越容易引起誤差。其實(shí)我比較擔(dān)心的是即使取前者的值也會(huì)偏高。因?yàn)槠毡榈默F(xiàn)象是稀釋n倍的濃度值小于稀釋2n倍乘以2的值，所以我懷疑稀釋n倍的濃度值乘以n也會(huì)高于蛋白原本濃度值。這是我最糾結(jié)的地方。 3樓2014-08-24 11:10:36
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4樓2015-03-20 20:47:04
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