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阿修羅Axuro金蟲 (小有名氣)
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十分詭異的電泳問題，已經(jīng)解決，分享給大家。 已有37人參與
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前幾天發(fā)了個帖，對于十分詭異的電泳問題的，現(xiàn)在已經(jīng)解決，找到問題了。 首先，我在那個帖子里一開始就說過了，我做過四年膠了，從來沒出過問題。 我也做過各種嘗試變換，問題依然沒有解決。很多回復(fù)的人都把這個問題想得很常規(guī)。但是四年做膠經(jīng)驗各種嘗試都沒解決，應(yīng)該知道并不是常規(guī)的問題。 昨天有一個蟲子 @ssssllllnnnn 認(rèn)為是marker嚴(yán)重過量，建議減少量，做個依次梯度。按建議做完后，發(fā)現(xiàn)減少到0.5ul時確實條帶比較好了。但是問題隨之而來了： 一，marker的說明書建議加5ul，為何5ul會不行？而需要減少到0.5ul。 二，蟲子我這四年來，做膠都是加5ul，有時候甚至隨手加到10ul，從未出過問題，為何現(xiàn)在5ul不行了？ 三，0.5ul雖然條帶比較好，但是根本不能實際應(yīng)用，因為亮度太弱，如果曝光時間延遲，則PCR產(chǎn)物條帶就成了一條巨粗無比的帶。 那么這里面肯定有蹊蹺。于是我決定把膠切開看看，一探究竟，先橫向切開，觀察加樣孔，發(fā)現(xiàn)加樣孔十分平滑，毫無問題。 然后縱向切開，用紫外燈照著，觀察條帶。有了很重要的發(fā)現(xiàn)：縱向來看，Marker的條帶并不是垂直的一條線，而是彎的。具體見第一張圖的示意。由于電泳的條 帶在縱向上不是一條垂直線，當(dāng)我們從上往下觀察電泳膠的時候，我們看到的條帶就會比較寬的，這樣就會形成重疊和拖尾嚴(yán)重的現(xiàn)象。 而減少Marker的量，由于Marker少了，并沒有把整個縱向填滿，當(dāng)Marker越少，就填得越低，這樣我們看到的條帶就越細(xì)，這樣減少Marker就能獲得比較正常而又清晰的條帶。但是減少Marker并沒有解決我的實驗的問題。 上面部分只是解釋了這些現(xiàn)象，為什么會這樣呢？當(dāng)我看到我的膠的縱切圖的時候，我馬上就反應(yīng)過來了：很明顯，膠不均勻，縱向來講上部分濃度較大，而下部分濃度低，這樣上面的DNA跑得慢，下面的跑得快，就形成了這個現(xiàn)象。 想到這里，我馬上想到了一個問題：我們做膠和電泳一直是在通風(fēng)櫥里面做，由于我們這棟樓是豆腐渣工程，一直以來，通風(fēng)櫥都是個擺設(shè)：沒有風(fēng)。由于很多老師實驗要求，幾個月前，院里把通風(fēng)櫥的風(fēng)道修好了，有風(fēng)了！��！這樣再在通風(fēng)櫥里面做膠的話，風(fēng)比較大，使膠的表面的水分流失很快。這樣就導(dǎo)致膠的表面部分濃度較高，而膠下部分濃度變化不大。 想完后，今天馬上動手，在通風(fēng)櫥外面做了一塊膠，果然不出所料，問題解決了。5ulmarker依然沒有問題。見附圖二。 20140828.jpg |
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-08-28 17:58:30
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-08-28 17:58:30
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我在加一點哈，是一個很猛的博士指點的：梳子對膠的影響也挺大，我們過去用厚梳子，配出來的膠單個孔的寬比較大，最后換成薄的，效果有很好的改善，原理跟樓主的差不多，見樓主圖2的理論分析。 除此之外，之前我們習(xí)慣用單排25孔的梳子，最后改成單排18孔的梳子，把膠配薄一點，跑得效果很不錯�，F(xiàn)在大家都用這種方案。 我們一般30個循環(huán)的PCR點10ul，我點過5ul，帶很清晰。 小提高拷貝質(zhì)粒pGEM的，10ul體系酶切1ul，點5ul的酶切樣品，跑得膠效果也很好，我們之前都是全點，現(xiàn)在我習(xí)慣點5ul。 |
6樓2014-08-28 17:13:39
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