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阿修羅Axuro金蟲 (小有名氣)
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十分詭異的電泳問(wèn)題，已經(jīng)解決，分享給大家。 已有37人參與
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前幾天發(fā)了個(gè)帖，對(duì)于十分詭異的電泳問(wèn)題的，現(xiàn)在已經(jīng)解決，找到問(wèn)題了。 首先，我在那個(gè)帖子里一開(kāi)始就說(shuō)過(guò)了，我做過(guò)四年膠了，從來(lái)沒(méi)出過(guò)問(wèn)題。 我也做過(guò)各種嘗試變換，問(wèn)題依然沒(méi)有解決。很多回復(fù)的人都把這個(gè)問(wèn)題想得很常規(guī)。但是四年做膠經(jīng)驗(yàn)各種嘗試都沒(méi)解決，應(yīng)該知道并不是常規(guī)的問(wèn)題。 昨天有一個(gè)蟲子 @ssssllllnnnn 認(rèn)為是marker嚴(yán)重過(guò)量，建議減少量，做個(gè)依次梯度。按建議做完后，發(fā)現(xiàn)減少到0.5ul時(shí)確實(shí)條帶比較好了。但是問(wèn)題隨之而來(lái)了： 一，marker的說(shuō)明書建議加5ul，為何5ul會(huì)不行？而需要減少到0.5ul。 二，蟲子我這四年來(lái)，做膠都是加5ul，有時(shí)候甚至隨手加到10ul，從未出過(guò)問(wèn)題，為何現(xiàn)在5ul不行了？ 三，0.5ul雖然條帶比較好，但是根本不能實(shí)際應(yīng)用，因?yàn)榱炼忍酰绻毓鈺r(shí)間延遲，則PCR產(chǎn)物條帶就成了一條巨粗無(wú)比的帶。 那么這里面肯定有蹊蹺。于是我決定把膠切開(kāi)看看，一探究竟，先橫向切開(kāi)，觀察加樣孔，發(fā)現(xiàn)加樣孔十分平滑，毫無(wú)問(wèn)題。 然后縱向切開(kāi)，用紫外燈照著，觀察條帶。有了很重要的發(fā)現(xiàn)：縱向來(lái)看，Marker的條帶并不是垂直的一條線，而是彎的。具體見(jiàn)第一張圖的示意。由于電泳的條 帶在縱向上不是一條垂直線，當(dāng)我們從上往下觀察電泳膠的時(shí)候，我們看到的條帶就會(huì)比較寬的，這樣就會(huì)形成重疊和拖尾嚴(yán)重的現(xiàn)象。 而減少M(fèi)arker的量，由于Marker少了，并沒(méi)有把整個(gè)縱向填滿，當(dāng)Marker越少，就填得越低，這樣我們看到的條帶就越細(xì)，這樣減少M(fèi)arker就能獲得比較正常而又清晰的條帶。但是減少M(fèi)arker并沒(méi)有解決我的實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題。 上面部分只是解釋了這些現(xiàn)象，為什么會(huì)這樣呢？當(dāng)我看到我的膠的縱切圖的時(shí)候，我馬上就反應(yīng)過(guò)來(lái)了：很明顯，膠不均勻，縱向來(lái)講上部分濃度較大，而下部分濃度低，這樣上面的DNA跑得慢，下面的跑得快，就形成了這個(gè)現(xiàn)象。 想到這里，我馬上想到了一個(gè)問(wèn)題：我們做膠和電泳一直是在通風(fēng)櫥里面做，由于我們這棟樓是豆腐渣工程，一直以來(lái)，通風(fēng)櫥都是個(gè)擺設(shè)：沒(méi)有風(fēng)。由于很多老師實(shí)驗(yàn)要求，幾個(gè)月前，院里把通風(fēng)櫥的風(fēng)道修好了，有風(fēng)了�。�！這樣再在通風(fēng)櫥里面做膠的話，風(fēng)比較大，使膠的表面的水分流失很快。這樣就導(dǎo)致膠的表面部分濃度較高，而膠下部分濃度變化不大。 想完后，今天馬上動(dòng)手，在通風(fēng)櫥外面做了一塊膠，果然不出所料，問(wèn)題解決了。5ulmarker依然沒(méi)有問(wèn)題。見(jiàn)附圖二。 20140828.jpg |
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阿修羅Axuro
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