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小科研女dow木蟲 (小有名氣)
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[求助]
構(gòu)建基因文庫的方法篩選到陽性克隆，克隆中插入的基因長為8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人參與
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各位蟲子們，大家好，小蟲今天提出一個長久困擾的問題，希望得到大家的建議，先謝過了~ 最近做基因文庫，采用的PUC19作為載體，將不完全酶切的片段插入該載體中后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過篩選得到陽性克隆，將陽性克隆單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒后送去測序公司測序，得到一個片段為8000bp的結(jié)果，以下為后續(xù)工作中遇到的問題： 1、目的基因應(yīng)該不至于是8000bp這么大，小蟲認(rèn)為實(shí)際的目的片段式這8000bp中的一部分，經(jīng)過軟件劃分ORF做了幾個閱讀框的表達(dá)，但是均無活性。 2、PUC19不是表達(dá)型質(zhì)粒，所以沒有辦法將篩選的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化到Rosetta和BL-21中大量表達(dá)，得不到目的蛋白。 3、曾經(jīng)見過有人對PUC19做過改造，可以用于表達(dá)蛋白，而不是僅僅用來克隆，但是自己經(jīng)驗(yàn)欠缺，沒有這方面的基礎(chǔ)。 4、還有人說，可以采用可以啟動表達(dá)的宿主菌，也只是聽說，并未接觸過。 樓主主要的目的是在這8000bp中尋覓到真正的目的片段，請問有什么好的意見嗎？先謝過了!  |
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冼亮淀粉酶
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找東西偶然找到了這個帖子，點(diǎn)開一看，發(fā)現(xiàn)時間已經(jīng)過去挺久了，不知道樓主的事情解決了沒有，我僅談?wù)勎业目捶ǎ?br />
1、確實(shí)，常見的單體蛋白質(zhì)的分子量如果有100KD就比較大了，就以這個分子量來計算吧。如果沒有內(nèi)含子，換算成DNA就是接近3KB，確實(shí)你這個8kb的片段里可能存在其它非目的基因的序列。 2、PUC19是表達(dá)型質(zhì)粒，可以表達(dá)外源蛋白質(zhì)。 3、不是啟動表達(dá)的宿主菌，而是可以通過加誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)質(zhì)粒上的啟動子，表達(dá)你克隆上去的目的基因。 4、經(jīng)過軟件劃分ORF是不完全靠譜的，僅僅可以供參考，因?yàn)槲以?jīng)在一個來自絲狀真菌的基因中找到8個ORF。你據(jù)此再克隆做了幾個閱讀框的表達(dá)，那就更加不應(yīng)該了。 5、正確的方法是亞克隆，這也是我用過的方法。就是選擇你的載體上沒有但在你的8KB外源片段上有2個或以上的酶切位點(diǎn)，完全酶切，再讓切出來的片段之間自連，連接產(chǎn)物中可能存在有活性的克隆，這樣就去掉了部分非目的基因的序列。視情況，運(yùn)氣好的時候僅用一個內(nèi)切酶就獲得含很少多余序列的片段，運(yùn)氣差的時候你的目的基因里有很多個內(nèi)切酶的位點(diǎn)，自連成為正確的序列的概率低，但也可以幫助你定位基因了。 另外，如果樓主已經(jīng)用PUC19做表達(dá)了，請告訴我，我也有此想法，謝謝！ |
13樓2015-11-09 01:42:11
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15樓2015-11-09 20:30:51
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17樓2015-11-10 20:02:11
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