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[交流] 關(guān)于Crizotinib對(duì)c-Met靶點(diǎn)抑制效果的實(shí)驗(yàn)

Crizotinib (PF-02341066)是一種有效的c-Met抑制劑，作用于人的c-Met激酶時(shí)，Ki為4 nM。
靶點(diǎn)：c-Met ALK
IC50：11 nM 24 nM
信號(hào)通路圖：

體外研究：Crizotinib (PF-02341066)作用于mIMCD3小鼠和MDCK犬上皮細(xì)胞，作用于c-Met磷酸化作用時(shí)具有相似效果，IC50分別為5 nM 和20 nM。Crizotinib作用于表達(dá)c-Met ATP-結(jié)合位點(diǎn)突變型V1092I 或H1094R或 P-環(huán)突變 M1250T 的NIH3T3 細(xì)胞，具有相似的活性，且活力增高，IC50分別為19 nM,2 nM 和15 nM,而作用于表達(dá)野生型受體的NIH3T3 細(xì)胞時(shí)，IC50為13 nM。相反, 觀察到Crizotinib作用于表達(dá)c-Met活化環(huán)突變型Y1230C 和Y1235D的細(xì)胞時(shí)，與作用于野生型受體相比，效果發(fā)生顯著改變，IC50分別為127 nM 和92 nM。

體內(nèi)研究：Crizotinib每天按100 mg/kg劑量口服處理攜帶Karpas299 ALCL 移植瘤的SCID Beige 小鼠，具有抗癌高效性，這種作用存在劑量依賴性，處理15天，所有腫瘤完全衰退。此外, PF-2341066抑制關(guān)鍵NPM-ALK信號(hào)調(diào)節(jié)器, 包括磷脂酶C-γ, 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器，及轉(zhuǎn)錄因子3, 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶, 和Akt的激活劑，這些與 NPM-ALK 磷酸化和功能受抑制相關(guān)。PF-2341066 抑制骨肉瘤的一些活動(dòng)行為，及其腫瘤生長(zhǎng)(例如, 增殖和存活)和轉(zhuǎn)移 (例如，入侵和形成克隆)。Crizotinib口服飼喂裸鼠，抑制生長(zhǎng)和相關(guān)的骨肉瘤裸鼠移植瘤的骨基質(zhì)的形成。PF-2341066 按50 mg/kg 劑量處理 c-MET-擴(kuò)增的GTL-16移植瘤，引起腫瘤衰退，這與18F-FDG 攝取的緩慢降低相關(guān)，且降低葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1, GLUT-1的表達(dá)。
生化激酶實(shí)驗(yàn)：使用連續(xù)耦合的分光光度測(cè)定c-Met催化活性，通過(guò)分析NADH消耗率而測(cè)定c-Met誘導(dǎo)的ADP產(chǎn)量，這種作用具有時(shí)間依賴性。在 340 nm處使用分光光度法在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光值的降低而計(jì)算NADH的消耗量。為了測(cè)定Ki值, 在含實(shí)驗(yàn)試劑的實(shí)驗(yàn)孔中加入不同濃度PF-2341066，然后在37oC下溫育10分鐘。加入c-Met酶開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。

細(xì)胞試驗(yàn):GTL-16胃癌細(xì)胞和T47D乳腺癌細(xì)胞接種在96孔板上，孔中含培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10% 胎牛血清(FBS)，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)血清培養(yǎng)基中[含0.04%牛血清蛋白(BSA)]，處理 24小時(shí)。在調(diào)查配體依賴的RTK 磷酸化實(shí)驗(yàn)中，加入相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，處理20分鐘。細(xì)胞和 PF-2341066和/或適當(dāng)配體在指定時(shí)間溫育1小時(shí)，然后使用含 1 mmol/L Na3VO4的HBSS沖洗細(xì)胞一次,然后從細(xì)胞中獲得蛋白裂解物。隨后,通過(guò)夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法使用特定的捕獲抗體在96孔板上測(cè)定選定蛋白激酶的磷酸化，使用特點(diǎn)檢測(cè)抗體測(cè)定磷酸化的酪氨酸殘基�？贵w包被的實(shí)驗(yàn)板(a) 在蛋白裂解物存在時(shí)，在4oC下過(guò)夜;(b)在溶于PBS的1% Tween-20 中沖洗7次;(c)在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗總磷酸（PY-20）抗體（1:500）中溫育20分鐘;(d) 再次沖洗7次;(e)在3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶底物中溫育，開(kāi)始顯示反應(yīng)，加入0.09 N H2SO4終止反應(yīng); (f)在450 nm 處使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

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1樓 2014-09-02 09:59:17

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