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小木蟲論壇-學(xué)術(shù)科研互動平臺 » 材料區(qū) » 生物材料 » 綜合其他 » 激光共聚焦
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xiaoyu0127銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
激光共聚焦 已有1人參與
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本人打算做激光共聚焦，新手一枚。翻閱了一些文獻(xiàn)學(xué)位論文，大致如下： 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱共孵育后棄去培養(yǎng)液。 PBS洗滌后用4%多聚甲醛37℃培養(yǎng)箱內(nèi)固定15分鐘； 棄去固定液并PBS漂洗3次后，用3%BSA封閉1小時；再次PBS洗滌后，用3%BSA配制的一抗4℃孵育過夜 。次日PBS漂洗3次后，加入Alexa Fluor 488熒光兔二抗室溫避光孵育2小時。 再PBS洗3次后，避光DAPI染色3分鐘。 最后用PBS避光漂洗3次，置于激光共聚焦顯微鏡（NIKON A1，100倍油鏡）成像觀察和采集圖像 但還有些疑問： 1.本人想做A與B在細(xì)胞上是否結(jié)合，不需要DAPI染色，是否只要將DAPI和PBS3次省略即可，前面相同； 2.A在膜上表達(dá)，B是熒光標(biāo)記的小分子，所以都不在細(xì)胞內(nèi)，是否還需要固定等增加通透性的流程； 歡迎各位提出寶貴意見，不勝感激。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiaoyu0127(紅舟流星代發(fā)): 金幣+5, 代扣代發(fā)金幣 2015-02-16 10:59:34
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xiaoyu0127(紅舟流星代發(fā)): 金幣+5, 代扣代發(fā)金幣 2015-02-16 10:59:34
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我之前做的是測定膜上兩分子在某細(xì)胞因子刺激后是否發(fā)生相互作用。主要的方法如下: 1、首先將細(xì)胞接種于激光共聚焦小室中（conning的，有兩孔、四孔、八孔等不同型號，看你實驗條件選擇），細(xì)胞接種盡量稀一點，最好能是細(xì)胞獨立生長，拍出來的圖像比較好看 2、待細(xì)胞成長至你所需密度時，開始免疫熒光實驗。（最好在下午做，一抗4℃過夜孵育效果比較好） 3、如果不需要加刺激因子，則直接棄掉培養(yǎng)基，PBS稍洗三次，加入4%多聚甲醛or95%甲醇固定10min即可（固定液的選擇主要看細(xì)胞，多聚甲醛固定后細(xì)胞會成圓形，而95%甲醇固定細(xì)胞能夠維持細(xì)胞原有形狀） 4、PBS洗滌三次，0.2%Triton X100打孔5min（膜上蛋白看結(jié)合位點，如果在膜表面則不需打孔） 5、PBS洗滌三次，加入5%BSA封閉37℃ 1h，封閉液使用量必須高于抗體使用量。 6、PBS洗滌三次，用1%BSA稀釋抗體，4℃過夜孵育。（經(jīng)驗來講，抗體濃度應(yīng)稍高于說明書的使用濃度） 7、PBS洗三次，每次5min（必須清洗干凈），以下步驟避光操作。 8、1%BSA稀釋熒光二抗，并孵育細(xì)胞1h，PBS洗三次，每次10min 9、DAPI or hochest染核，PBS洗三次，每次5min（可省略） 10、激光共聚焦顯微鏡下成像。 希望能對你有幫助 |
2樓2014-09-11 12:00:13
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