版塊導航: 正在加載中...

登錄注冊

應《網(wǎng)絡安全法》要求，自2017年10月1日起，未進行實名認證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務。為保障您的帳號能夠正常使用，請盡快對帳號進行手機號驗證，感謝您的理解與支持！

24小時熱門版塊排行榜

返回列表

xiaoyu0127

銅蟲 (小有名氣)

應助: 0 (幼兒園)
金幣: 215.4
帖子: 107
在線: 46.7小時
蟲號: 2172917
注冊: 2012-12-07
性別: MM
專業(yè): 生物化學

[求助] 激光共聚焦已有1人參與

本人打算做激光共聚焦，新手一枚。翻閱了一些文獻學位論文，大致如下：
37℃細胞培養(yǎng)箱共孵育后棄去培養(yǎng)液。
PBS洗滌后用4%多聚甲醛37℃培養(yǎng)箱內固定15分鐘；
棄去固定液并PBS漂洗3次后，用3%BSA封閉1小時；再次PBS洗滌后，用3%BSA配制的一抗4℃孵育過夜
。次日PBS漂洗3次后，加入Alexa Fluor 488熒光兔二抗室溫避光孵育2小時。
再PBS洗3次后，避光DAPI染色3分鐘。
最后用PBS避光漂洗3次，置于激光共聚焦顯微鏡（NIKON A1，100倍油鏡）成像觀察和采集圖像
但還有些疑問：
1.本人想做A與B在細胞上是否結合，不需要DAPI染色，是否只要將DAPI和PBS3次省略即可，前面相同；
2.A在膜上表達，B是熒光標記的小分子，所以都不在細胞內，是否還需要固定等增加通透性的流程；
歡迎各位提出寶貴意見，不勝感激。

回復此樓

» 猜你喜歡

一志愿暨大生物學290求求調劑已經(jīng)有8人回復
廈大309分生物與醫(yī)藥調劑已經(jīng)有0人回復
生物力學與組織工程學論文潤色/翻譯怎么收費? 已經(jīng)有241人回復
334生物求調劑已經(jīng)有0人回復
一志愿中山大學生物學，295分，求A區(qū)調劑已經(jīng)有2人回復
求助化合物CD數(shù)據(jù)的處理已經(jīng)有0人回復
廣州醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院生物醫(yī)學工程工學-083100 招生已經(jīng)有5人回復
一志愿湖南大學生物學332分有國獎+省級已經(jīng)有1人回復
美國南加大(USC)藥學院Prof. Yong (Tiger) Zhang課題組誠聘博士后已經(jīng)有0人回復
湖北工業(yè)大學食品科學與工程系課題組招收2026級食品/生物醫(yī)藥碩士生（含調劑）已經(jīng)有0人回復

» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)

1樓 2014-09-09 23:03:30

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

妃歌sindy

新蟲 (初入文壇)

應助: 1 (幼兒園)
金幣: 10.5
帖子: 2
在線: 2.4小時
蟲號: 3409310
注冊: 2014-09-11
專業(yè): 細胞生物學

【答案】應助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
xiaoyu0127(紅舟流星代發(fā)): 金幣+5, 代扣代發(fā)金幣 2015-02-16 10:59:34

我之前做的是測定膜上兩分子在某細胞因子刺激后是否發(fā)生相互作用。主要的方法如下:
1、首先將細胞接種于激光共聚焦小室中（conning的，有兩孔、四孔、八孔等不同型號，看你實驗條件選擇），細胞接種盡量稀一點，最好能是細胞獨立生長，拍出來的圖像比較好看
2、待細胞成長至你所需密度時，開始免疫熒光實驗。（最好在下午做，一抗4℃過夜孵育效果比較好）
3、如果不需要加刺激因子，則直接棄掉培養(yǎng)基，PBS稍洗三次，加入4%多聚甲醛or95%甲醇固定10min即可（固定液的選擇主要看細胞，多聚甲醛固定后細胞會成圓形，而95%甲醇固定細胞能夠維持細胞原有形狀）
4、PBS洗滌三次，0.2%Triton X100打孔5min（膜上蛋白看結合位點，如果在膜表面則不需打孔）
5、PBS洗滌三次，加入5%BSA封閉37℃ 1h，封閉液使用量必須高于抗體使用量。
6、PBS洗滌三次，用1%BSA稀釋抗體，4℃過夜孵育。（經(jīng)驗來講，抗體濃度應稍高于說明書的使用濃度）
7、PBS洗三次，每次5min（必須清洗干凈），以下步驟避光操作。
8、1%BSA稀釋熒光二抗，并孵育細胞1h，PBS洗三次，每次10min
9、DAPI or hochest染核，PBS洗三次，每次5min（可省略）
10、激光共聚焦顯微鏡下成像。
希望能對你有幫助

贊一下(2人)

回復此樓

2樓2014-09-11 12:00:13

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

相關版塊跳轉我要訂閱樓主 xiaoyu0127 的主題更新