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洛洛丫頭新蟲 (初入文壇)
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[求助]
用鏈霉菌菌絲體做結(jié)合轉(zhuǎn)移得不到結(jié)合子，求大神指點(diǎn)？
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我是用pkc1139質(zhì)粒構(gòu)建的載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567( pUZ8002)中，與波塞鏈霉菌進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移，基本方法如下： 將鏈霉菌從斜面接種于50mLTSB培養(yǎng)基中,28℃震蕩培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長后期, 離心收集菌絲( 4000r/min, 10min, 4% ), 洗滌后重懸于20mLLB培養(yǎng)基中, 作為受體菌; 將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Ecoli ET12567( pUZ8002)感受態(tài)細(xì)胞, 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基(含Apr50g/mL、卡那霉素 25 g/mL、氯霉素25g/mL), 37%振蕩培養(yǎng)12h, 2%接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中(含Apr50g/mL、卡那霉素25g/mL、氯霉素25g/mL), 37% 振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到04~ 06, 離心收集菌絲并洗滌后, 將菌絲重懸于1~2mLLB培養(yǎng)基中, 作為供體菌; 取適量供體菌與受體菌混勻, 并均勻涂布于MS培養(yǎng)基平板, 28%靜置培養(yǎng)20h后加蓋抗生素(Apr與奈啶酮酸終濃度均為50g/mL), 37℃ 靜置培養(yǎng)7d, 挑取陽性接合子。 我已經(jīng)做了好幾個(gè)月了，還是沒有長結(jié)合子，求高人指點(diǎn)？ |
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2樓2015-12-29 15:18:41
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3樓2016-10-10 14:12:57
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