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努力從容1s管理員
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腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)遇到問(wèn)題了，望眾多蟲(chóng)友不吝賜教！ 已有2人參與
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養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞的前輩們，lz培養(yǎng)大腸癌干細(xì)胞遇到一些問(wèn)題，不知道你們以前遇到過(guò)嗎？ 1、不加血清的培基分離腫瘤干細(xì)胞：由于干細(xì)胞只是很小一部分，種到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞大多數(shù)都要死亡，只有少數(shù)自我更新成球。原代培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞長(zhǎng)得時(shí)間比較長(zhǎng)，我的培養(yǎng)瓶中會(huì)出現(xiàn)黑色圓圓的東西，培基還是很清澈的，那些是細(xì)胞碎片嗎？大家原代細(xì)胞狀態(tài)是怎么樣的？ 1.用不加血清的培基分離腫瘤干細(xì)胞后，3-5天成球，一周后我傳代種板做細(xì)胞試驗(yàn)，但問(wèn)題是傳代后，培養(yǎng)瓶細(xì)胞長(zhǎng)得很慢，死細(xì)胞也很多，是消化損傷到干細(xì)胞造成的嗎？（我是這樣傳代的，先收集懸浮細(xì)胞，800r/min離心5min，棄上清，PBS重懸清洗，再離心棄上清，加0.05%TE消化30秒，終止消化，離心用不含血清的全培重懸，然后接種到培養(yǎng)瓶中和用于細(xì)胞試驗(yàn)。）你們是怎么傳代的？ 2、細(xì)胞試驗(yàn)中，96孔板里面細(xì)胞只長(zhǎng)48h，這樣短的時(shí)間傳代的細(xì)胞正常生長(zhǎng)是什么狀態(tài)呢？應(yīng)該不能成球吧，我檢測(cè)的不加藥的細(xì)胞活性很低很低，真是傷心啊！是哪里出問(wèn)題了呢？ |
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4樓2014-10-13 15:21:02
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支原體污染Q&A 1、Q: 支原體污染對(duì)細(xì)胞有什么危害？ A: 支原體污染后，不會(huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì) 胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細(xì)胞收到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形， 影響 DNA 合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等，以致影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。 2、Q: 支原體污染有什么特征？ A: 細(xì)胞狀態(tài)變差,生長(zhǎng)變慢，在顯微鏡下觀察可能會(huì)有小黑點(diǎn)，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生 渾濁。細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，很多類(lèi)似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì) 胞漂浮，完全死亡。具體特征請(qǐng)見(jiàn)附件 2。 3、Q: 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，顯微鏡下的小黑點(diǎn)是什么？ A: 支原體污染后，細(xì)胞凋亡壞死，釋放出大量碎片，看起來(lái)就像小黑蟲(chóng)子。 4、Q: 細(xì)胞通過(guò)何種途徑感染支原體？ A: 支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是 正常菌群如口腔中的支原體）、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材 的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染等等，由于支原體大小為 0.1~0.8 um，無(wú)細(xì) 胞壁，可透過(guò)一般過(guò)濾膜（0.22-0.45 um），血清中也可能含有支原體。 5、Q: 支原體污染如何檢測(cè)？ A: 利用支原體具特殊專(zhuān)一性之 primers，經(jīng)由 PCR 反應(yīng)來(lái)復(fù)制支原體 DNA。所用 primers 來(lái)自支原體的 conserved 16S-23S rRNA 序列，由于此段序列依支原體種類(lèi)不同而不同， 因此可依所復(fù)制之 DNA 大小及其 restriction fragment 大小差異來(lái)作偵測(cè)與鑒定支原體 （具體方法見(jiàn)附件）。 6、Q: 如何清除支原體？ A: 由于市場(chǎng)同類(lèi)產(chǎn)品都為抗生素類(lèi)，對(duì)細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響，而且有反復(fù)發(fā) 作的風(fēng)險(xiǎn)，吉銳生物推出的 MycoplasmaOUT™ Treatment，活性成分為抗菌肽，經(jīng)多方測(cè)試表明對(duì) 大部分細(xì)胞無(wú)毒害作用，因其獨(dú)特的作用原理，支原體不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，并且其作 用時(shí)間短，在三天內(nèi)就可殺滅支原體，并自動(dòng)降解成氨基酸，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成二次污染。 7、Q: 為什么在培養(yǎng)細(xì)胞前要加入MycoplasmaOUT™ Prevention？ A：由于支原體污染后能夠進(jìn)入細(xì)胞，而MycoplasmaOUT™ Prevention不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)也就不能殺滅已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的支原體，而這部分細(xì)胞死亡時(shí)會(huì)釋放其內(nèi)部的支原體，需要MycoplasmaOUT™ Prevention來(lái)殺滅新釋放出的支原體，以防止新生細(xì)胞受到污染。 8、Q: 所謂的黑膠蟲(chóng)污染？ A:培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)小黑點(diǎn)現(xiàn)象很?chē)?yán)重，原來(lái)對(duì)“黑膠蟲(chóng)”一說(shuō)嗤之以鼻，認(rèn)為那不過(guò)是自欺欺人的借口，覺(jué)得怎么也不會(huì)發(fā)生在自己身上。但是真的就碰上了：細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，很多類(lèi)似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，完全死亡。 上述現(xiàn)象很像所謂的“黑膠蟲(chóng)”。 我感覺(jué)實(shí)際是支原體感染以后細(xì)胞生長(zhǎng)不好造成的碎片和感染原蟲(chóng)（現(xiàn)在看來(lái)是些胞外囊泡）的混合體。這種現(xiàn)象的直接原因是支原體等原蟲(chóng)感染，間接表象是小黑點(diǎn)，被以訛傳訛成為了“黑膠蟲(chóng)”。 光鏡下看不到支原體，但是可以看到支原體感染的終末現(xiàn)象——細(xì)胞凋亡壞死，釋放出大量碎片，看起來(lái)就像小黑蟲(chóng)子。 查找類(lèi)似的帖子——很多人是更換血清后出現(xiàn)這種問(wèn)題； 說(shuō)空氣傳播的可能是一個(gè)培養(yǎng)箱的人都用了同一種血清，而不是可以通過(guò)培養(yǎng)箱空氣傳播；感染最可能是牛源性的支原體，通過(guò)產(chǎn)道或血行感染。 所謂“細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響”，其實(shí)是污染的嚴(yán)重程度不高而已； 支原體污染嚴(yán)重就出現(xiàn)細(xì)胞大量空泡形成，細(xì)胞間空曠地帶出現(xiàn)大量黑點(diǎn)，細(xì)胞最終凋亡、壞死，漂起來(lái)。有些國(guó)產(chǎn)血清寫(xiě)著建議滅活，其實(shí)是掛羊頭賣(mài)狗肉，那個(gè)56度30分鐘更多的是為了殺殺支原體的。實(shí)際上還有很多殺不死的。但可以降低產(chǎn)品支原體等微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。用阿奇霉素殺支原體，小黑點(diǎn)可以得到抑制，不過(guò)我想根治就很難了，而且處理時(shí)間很長(zhǎng)，至少一個(gè)星期。 以上是自己個(gè)人總結(jié)的一點(diǎn)看法。建議不要總拿子虛烏有的“黑膠蟲(chóng)”來(lái)說(shuō)事。多考慮看不到的支原體，不要還停留在培根時(shí)代——只相信自己眼睛看見(jiàn)的。 |
2樓2014-10-10 14:28:54
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| 污染情況對(duì)比，看是不是這個(gè)樣子的 |
3樓2014-10-10 14:31:12
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5樓2014-10-13 15:22:07
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