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專業(yè): 病原細(xì)菌與放線菌生物學(xué)

[交流] 【原創(chuàng)】第三代測序于農(nóng)業(yè)相關(guān)研究中的應(yīng)用

由美國Pacbio公司開發(fā)研制的單分子實時測序在歷史上首次實現(xiàn)了人類觀測單個DNA聚合酶過程的夢想。該技術(shù)通過光學(xué)方法直接記錄單個聚合酶在不受干擾的情況下的連續(xù)合成，已經(jīng)使許多極富挑戰(zhàn)性的基因組學(xué)研究成為可能。這種以Pacbio技術(shù)為代表的模擬天然DNA復(fù)制過程的新型測序方法被稱為第三代測序技術(shù)。該技術(shù)不僅融合了天然DNA復(fù)制高效準(zhǔn)確的特點，而且是可以在不影響聚合酶活性的前提下實時觀測DNA合成，由于聚合酶的平均反應(yīng)速度可達(dá)1bp/s以上，因為其測序速度比Sanger測序快了幾萬倍。參與第三測序技術(shù)研發(fā)的Korlach與Tuener，于2009年2月在《Science》雜志上發(fā)表了一篇介紹Pacbio單分子DNA測序技術(shù)的文章，代表了第三代測序技術(shù)的原理驗證。其后，他們又利用SMRT技術(shù)，直接測定了DNA的甲基化，一成果發(fā)布在2011年5月的《Nature Met-hods》上。
一， Pacbio技術(shù)應(yīng)用于水稻基因組的研究
冷泉港的Schat M 將Pacbio技術(shù)應(yīng)用于水稻基因組的測序與拼接，通過XL/C2試劑進行測序。結(jié)果產(chǎn)生了平均讀長3290bp，最大長度超過24kbp的數(shù)據(jù)。初始數(shù)據(jù)是原始基因組覆蓋度的10倍，經(jīng)修正也達(dá)到了6.2倍。50%的水稻基因組數(shù)據(jù)讀長超過4800bp。僅使用長讀長校正過的Pacbio數(shù)據(jù)進行拼接，基因組N50=13kbp。而將經(jīng)校正的Pacbio數(shù)據(jù)與illumina數(shù)據(jù)進行混合拼接，使基因組N50達(dá)到25kbp（圖4）。由此可見，通過NGS和第三代測序數(shù)據(jù)的混合拼接,可以大幅提高基因組拼接效率。NGS平臺所獲得的海量數(shù)據(jù)量，可在Pacbio測序步驟得到解讀，從中獲得更多有益的信息。

Peter A Larsen 等運用Pacbio單分子實時測序技術(shù)對4頭牛的免疫球蛋白IgG重鏈可變區(qū)的cDNA進行了測序。通過提取血液的RNA，反轉(zhuǎn)錄并特異性擴增抗體可變區(qū)，產(chǎn)生了49945個高質(zhì)量序列。從中確定了49521個抗原結(jié)合區(qū)域。發(fā)現(xiàn)獨特CDR3序列的一段長度為5-6和21-25氨基酸。隨著CDR3 長度增加，半胱氨酸殘基數(shù)也在增加，且位于CDR3s中心部位。實驗發(fā)現(xiàn)在免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄組中有19個極長的CDR3序列（62個氨基酸）。最終分析揭示所有實驗個體中產(chǎn)生的抗體抗原結(jié)合區(qū)的不同類型（圖5）。
冷泉港實驗室運用Pacbio技術(shù)對玉米幼苗的cDNA進行了檢測，得到了大約817bp長度的50130個redas，之后用17.8的illumina的數(shù)據(jù)，通過對PBcr進行錯誤矯正，最終99.1%與參照序列一致（圖6）。
他們還對綿羊重要病原體Bibersteinia trehalosi 進行了測序，B.trehalosi主要引起綿羊嚴(yán)重系統(tǒng)性肺部感染。8個SMRT cell的Pacbio數(shù)據(jù)，獲得了超過224*福海率，33*覆蓋率數(shù)據(jù)大于6kb。覆蓋了整個重復(fù)區(qū)域，這就使得校正過的Pacbio長讀長數(shù)據(jù)（大于6kb）可以直接拼接成為1個完成Contig(圖7)。

二，天津生物芯片大型生物基因組測序策略及實例
（1）某植物基因組測序，基因組大小為350Mb，高度純化
（2）應(yīng)用NGS+PacBio+Optical Mapping的策略
①NGS De novo拼接獲得基礎(chǔ)拼接版本；
②利用PacBio長讀長構(gòu)建scaffolds，并進行g(shù)aps填補；
③利用Optical Mapping進行指導(dǎo)拼接，構(gòu)建super-scaffolds經(jīng)過拼接優(yōu)化，最終我們獲得高度完整的基因組序列；
④ 拼接結(jié)果最大scaffolds長度超過20Mb，全部scaffolds N50值超過10Mb；
⑤并且通過BAC-FISH雜交技術(shù)，將其中大部分序列定位到染色體水平。
Pacbio單分子實時測序技術(shù)已經(jīng)開始運用到農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究中，必將成為農(nóng)業(yè)相關(guān)基因組測序的一個新的推動力，有利于發(fā)現(xiàn)更多地農(nóng)作物增產(chǎn)，抗逆，抗蟲相關(guān)基因及牲畜病相關(guān)基因，促進了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，助力人類生活的進步。

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附件 1 : 第三代測序于農(nóng)業(yè)相關(guān)研究中的應(yīng)用.doc

2014-10-31 16:30:31, 515 K

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1樓 2014-10-31 16:31:15

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2樓2014-11-04 13:15:06