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專業(yè): 病原細菌與放線菌生物學

[交流] 【原創(chuàng)】第三代測序于農(nóng)業(yè)相關研究中的應用

由美國Pacbio公司開發(fā)研制的單分子實時測序在歷史上首次實現(xiàn)了人類觀測單個DNA聚合酶過程的夢想。該技術通過光學方法直接記錄單個聚合酶在不受干擾的情況下的連續(xù)合成，已經(jīng)使許多極富挑戰(zhàn)性的基因組學研究成為可能。這種以Pacbio技術為代表的模擬天然DNA復制過程的新型測序方法被稱為第三代測序技術。該技術不僅融合了天然DNA復制高效準確的特點，而且是可以在不影響聚合酶活性的前提下實時觀測DNA合成，由于聚合酶的平均反應速度可達1bp/s以上，因為其測序速度比Sanger測序快了幾萬倍。參與第三測序技術研發(fā)的Korlach與Tuener，于2009年2月在《Science》雜志上發(fā)表了一篇介紹Pacbio單分子DNA測序技術的文章，代表了第三代測序技術的原理驗證。其后，他們又利用SMRT技術，直接測定了DNA的甲基化，一成果發(fā)布在2011年5月的《Nature Met-hods》上。
一， Pacbio技術應用于水稻基因組的研究
冷泉港的Schat M 將Pacbio技術應用于水稻基因組的測序與拼接，通過XL/C2試劑進行測序。結(jié)果產(chǎn)生了平均讀長3290bp，最大長度超過24kbp的數(shù)據(jù)。初始數(shù)據(jù)是原始基因組覆蓋度的10倍，經(jīng)修正也達到了6.2倍。50%的水稻基因組數(shù)據(jù)讀長超過4800bp。僅使用長讀長校正過的Pacbio數(shù)據(jù)進行拼接，基因組N50=13kbp。而將經(jīng)校正的Pacbio數(shù)據(jù)與illumina數(shù)據(jù)進行混合拼接，使基因組N50達到25kbp（圖4）。由此可見，通過NGS和第三代測序數(shù)據(jù)的混合拼接,可以大幅提高基因組拼接效率。NGS平臺所獲得的海量數(shù)據(jù)量，可在Pacbio測序步驟得到解讀，從中獲得更多有益的信息。

Peter A Larsen 等運用Pacbio單分子實時測序技術對4頭牛的免疫球蛋白IgG重鏈可變區(qū)的cDNA進行了測序。通過提取血液的RNA，反轉(zhuǎn)錄并特異性擴增抗體可變區(qū)，產(chǎn)生了49945個高質(zhì)量序列。從中確定了49521個抗原結(jié)合區(qū)域。發(fā)現(xiàn)獨特CDR3序列的一段長度為5-6和21-25氨基酸。隨著CDR3 長度增加，半胱氨酸殘基數(shù)也在增加，且位于CDR3s中心部位。實驗發(fā)現(xiàn)在免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄組中有19個極長的CDR3序列（62個氨基酸）。最終分析揭示所有實驗個體中產(chǎn)生的抗體抗原結(jié)合區(qū)的不同類型（圖5）。
冷泉港實驗室運用Pacbio技術對玉米幼苗的cDNA進行了檢測，得到了大約817bp長度的50130個redas，之后用17.8的illumina的數(shù)據(jù)，通過對PBcr進行錯誤矯正，最終99.1%與參照序列一致（圖6）。
他們還對綿羊重要病原體Bibersteinia trehalosi 進行了測序，B.trehalosi主要引起綿羊嚴重系統(tǒng)性肺部感染。8個SMRT cell的Pacbio數(shù)據(jù)，獲得了超過224*福海率，33*覆蓋率數(shù)據(jù)大于6kb。覆蓋了整個重復區(qū)域，這就使得校正過的Pacbio長讀長數(shù)據(jù)（大于6kb）可以直接拼接成為1個完成Contig(圖7)。

二，天津生物芯片大型生物基因組測序策略及實例
（1）某植物基因組測序，基因組大小為350Mb，高度純化
（2）應用NGS+PacBio+Optical Mapping的策略
①NGS De novo拼接獲得基礎拼接版本；
②利用PacBio長讀長構(gòu)建scaffolds，并進行gaps填補；
③利用Optical Mapping進行指導拼接，構(gòu)建super-scaffolds經(jīng)過拼接優(yōu)化，最終我們獲得高度完整的基因組序列；
④ 拼接結(jié)果最大scaffolds長度超過20Mb，全部scaffolds N50值超過10Mb；
⑤并且通過BAC-FISH雜交技術，將其中大部分序列定位到染色體水平。
Pacbio單分子實時測序技術已經(jīng)開始運用到農(nóng)業(yè)領域的基礎研究中，必將成為農(nóng)業(yè)相關基因組測序的一個新的推動力，有利于發(fā)現(xiàn)更多地農(nóng)作物增產(chǎn)，抗逆，抗蟲相關基因及牲畜病相關基因，促進了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，助力人類生活的進步。

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附件 1 : 第三代測序于農(nóng)業(yè)相關研究中的應用.doc

2014-10-31 16:30:31, 515 K

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2樓2014-11-04 13:15:06