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王丹523

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我有五個(gè)基因，如果我用一個(gè)模板這樣去做qpcr。我不太懂溶解曲線和擴(kuò)增曲線的原理。
所以我是每次做一個(gè)基因，跑一次能同時(shí)得到溶解曲線和擴(kuò)增曲線？還是能夠五個(gè)基因一起跑。
我不知道溶解曲線和擴(kuò)增曲線是分別跑出來(lái)的還是一次跑出來(lái)的。
機(jī)子是abi7500。用的syber green takara的。

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1樓 2014-11-05 12:00:00

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bbqlhb

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王丹523(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-05 14:23:56

ABI7500，有多個(gè)通道，所以可以同時(shí)測(cè)幾個(gè)基因，但是最好一個(gè)基因一個(gè)基因的測(cè)，因?yàn)槿芙馇€是只有一條。
你選擇melting curve那個(gè)才能做出熔解曲線，更多的話請(qǐng)參考說(shuō)明書吧。

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2樓2014-11-05 13:14:59

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wxk19960113

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2樓: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 13:14:59
ABI7500，有多個(gè)通道，所以可以同時(shí)測(cè)幾個(gè)基因，但是最好一個(gè)基因一個(gè)基因的測(cè)，因?yàn)槿芙馇€是只有一條。
你選擇melting curve那個(gè)才能做出熔解曲線，更多的話請(qǐng)參考說(shuō)明書吧。

可以五個(gè)基因一起跑，因?yàn)橛胁煌伾鳂?biāo)記，擴(kuò)增曲線和溶解曲線是分別跑的。

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3樓2014-11-05 13:40:33

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3樓: Originally posted by wxk19960113 at 2014-11-05 13:40:33
可以五個(gè)基因一起跑，因?yàn)橛胁煌伾鳂?biāo)記，擴(kuò)增曲線和溶解曲線是分別跑的。...

所以說(shuō) 我先relative qualification 一次跑五個(gè)基因，加一個(gè)actin，然后再跑melt curve 一次跑五個(gè)基因，加一個(gè)actin，數(shù)據(jù)導(dǎo)出分析？是這樣嗎？

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4樓2014-11-05 14:16:41

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我有說(shuō)明說(shuō) ， abi 厚厚的一本，上面只是說(shuō)了程序的設(shè)定
我想知道一次可以跑幾個(gè)melt curve，還是每次跑一個(gè)基因做溶解曲線和擴(kuò)增曲線

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5樓2014-11-05 14:19:04

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王丹523(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-08 20:02:46

引用回帖:

5樓: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 14:19:04
我有說(shuō)明說(shuō) ， abi 厚厚的一本，上面只是說(shuō)了程序的設(shè)定
我想知道一次可以跑幾個(gè)melt curve，還是每次跑一個(gè)基因做溶解曲線和擴(kuò)增曲線...

我說(shuō)的是一個(gè)孔的情況。
因?yàn)槟阌玫氖莝yber green，而它的原理是只要有DNA復(fù)制就算一個(gè)擴(kuò)增，所以是分不出來(lái)5個(gè)的。。如果要同時(shí)測(cè)5個(gè)基因就需要用不同探針，根據(jù)不同通道來(lái)查看。
而熔解曲線是專門為syber green做的，因?yàn)闆](méi)有探針那么準(zhǔn)確定量，所以要查看熔解曲線以便分辨所得的是否為我們需要的產(chǎn)物。
因此不需要換探針，只需要分開(kāi)5個(gè)孔分別測(cè)5個(gè)基因，上機(jī)測(cè)熔解曲線就OK了

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6樓2014-11-05 14:33:13

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6樓: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 14:33:13
我說(shuō)的是一個(gè)孔的情況。
因?yàn)槟阌玫氖莝yber green，而它的原理是只要有DNA復(fù)制就算一個(gè)擴(kuò)增，所以是分不出來(lái)5個(gè)的。。如果要同時(shí)測(cè)5個(gè)基因就需要用不同探針，根據(jù)不同通道來(lái)查看。
而熔解曲線是專門為syber gree ...

我們用的是sybr green 。熔解曲線不是要濃度梯度嗎？如果我設(shè)2倍稀釋，5個(gè)梯度，3個(gè)重復(fù)，這樣可以嗎？一個(gè)96孔板我可以把6個(gè)基因的熔解曲線全部跑完（actin也要做熔解曲線的吧）

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7樓2014-11-05 15:11:17

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王丹523(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-08 20:03:00

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7樓: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 15:11:17
我們用的是sybr green 。熔解曲線不是要濃度梯度嗎？如果我設(shè)2倍稀釋，5個(gè)梯度，3個(gè)重復(fù)，這樣可以嗎？一個(gè)96孔板我可以把6個(gè)基因的熔解曲線全部跑完（actin也要做熔解曲線的吧）...

不是熔解曲線要濃度梯度，而是作標(biāo)準(zhǔn)曲線要濃度梯度。
5對(duì)基因，5對(duì)引物。
每一個(gè)基因做3個(gè)重復(fù)，5個(gè)梯度，共15孔。5個(gè)基因要75孔，96孔夠了。
你排好板，先做個(gè)表格哪個(gè)孔加了什么，然后再加不會(huì)出錯(cuò)。

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8樓2014-11-05 15:24:56

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再插一句，做標(biāo)準(zhǔn)曲線要先做一次單孔定量PCR，不然你怎么知道要稀釋多少倍才是正確的？重做還浪費(fèi)試劑。

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9樓2014-11-05 15:30:06

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9樓: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 15:30:06
再插一句，做標(biāo)準(zhǔn)曲線要先做一次單孔定量PCR，不然你怎么知道要稀釋多少倍才是正確的？重做還浪費(fèi)試劑。...

我連標(biāo)準(zhǔn)曲線，熔解曲線都分不清了，有沒(méi)有什么參考資料，能給我看看啊，網(wǎng)上全部是一些看過(guò)的原理，再詳細(xì)一點(diǎn)的就搜不到了

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10樓2014-11-05 15:56:19

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