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拋磚引玉:關于引物設計中自由能的問題 已有1人參與
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首先關于我個人，我沒有做過多少實驗，主要是進行理論研究。如果有什么不對的地方，請指正，互相學習。 關于引物設計，網上有各種理論，許多理論甚至是沖突的。我很懷疑這些理論的出處，是否經過了實踐的檢驗。 我也咨詢過許多設計過引物的科研人員，對此，我感覺他們也都沒有一個定性。所以我特別迷茫。 關于3'端的穩(wěn)定性的問題，我說一下我的理解。 穩(wěn)定性是一個俗語，科學的說法應該是在一定溫度下的自由能。 gc含量、tm值和自由能的絕對值是成正比關系的。 DNA雙鏈結合過程基本上是一個釋放能量的過程，而變性過程(解開雙鏈)則是一個吸收能量的過程。 這就意味著，結合越穩(wěn)定，那破壞它就需要更多的能量，而能量只能來自于溫度。 在3'端穩(wěn)定性大于5'端穩(wěn)定性的情況下 從變性溫度94到引物退火溫度(假定為55度)的過程中，引物會與模板自動結合，當穩(wěn)定到55度時，已經有一半以上的引物結合在了模板上(3'端結合，5'端處于游離狀態(tài))。當溫度再次升高到72度時，因為溫度的升高并不足以破壞3'端與模板的結合，所以在Taq酶和鎂離子的作用下，引物的3'端會與dNTP結合，實現延伸。 這就意味著，如果3'端穩(wěn)定性極差，非常有可能在溫度達到72度時，引物從模板上脫落，造成延伸失敗。 換一種情況，如果3'端有錯配，則溫度在55度時，引物極有可能錯配。 當溫度升高到72度時，溫度所提供的能量不足以破壞3'端的錯配，那就會出現非特異性擴增。這可不是我們所想要的。 在5'端穩(wěn)定性大于3'端穩(wěn)定性的情況下 我個人認為，當溫度穩(wěn)定在55度時，是5'端結合在了模板上，3'端處于游離狀態(tài)，事實是否這樣，我不知道。 假定我的認為是正確的，那當溫度72度時，3'端已經有一大部分結合在了模板上。同上，可以實現延伸。 在這種情況下，3'端的自由能越大，在72度時，3'端與模板結合的越多。相反，3'端自由能越小，那結合的越少，小到一定程序，有可能就根本無法延伸。 在實現情況下，引物100%的有錯配，所以，由此可知，引物的3'端的自由能，不要太高，但也不要太低。 給出一個參考值: 9 > abs(dG) > 4。5 |
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2樓2019-03-01 10:20:00
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