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utryer新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
拋磚引玉:關(guān)于引物設(shè)計(jì)中自由能的問(wèn)題 已有1人參與
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首先關(guān)于我個(gè)人，我沒(méi)有做過(guò)多少實(shí)驗(yàn)，主要是進(jìn)行理論研究。如果有什么不對(duì)的地方，請(qǐng)指正，互相學(xué)習(xí)。 關(guān)于引物設(shè)計(jì)，網(wǎng)上有各種理論，許多理論甚至是沖突的。我很懷疑這些理論的出處，是否經(jīng)過(guò)了實(shí)踐的檢驗(yàn)。 我也咨詢(xún)過(guò)許多設(shè)計(jì)過(guò)引物的科研人員，對(duì)此，我感覺(jué)他們也都沒(méi)有一個(gè)定性。所以我特別迷茫。 關(guān)于3'端的穩(wěn)定性的問(wèn)題，我說(shuō)一下我的理解。 穩(wěn)定性是一個(gè)俗語(yǔ)，科學(xué)的說(shuō)法應(yīng)該是在一定溫度下的自由能。 gc含量、tm值和自由能的絕對(duì)值是成正比關(guān)系的。 DNA雙鏈結(jié)合過(guò)程基本上是一個(gè)釋放能量的過(guò)程，而變性過(guò)程(解開(kāi)雙鏈)則是一個(gè)吸收能量的過(guò)程。 這就意味著，結(jié)合越穩(wěn)定，那破壞它就需要更多的能量，而能量只能來(lái)自于溫度。 在3'端穩(wěn)定性大于5'端穩(wěn)定性的情況下 從變性溫度94到引物退火溫度(假定為55度)的過(guò)程中，引物會(huì)與模板自動(dòng)結(jié)合，當(dāng)穩(wěn)定到55度時(shí)，已經(jīng)有一半以上的引物結(jié)合在了模板上(3'端結(jié)合，5'端處于游離狀態(tài))。當(dāng)溫度再次升高到72度時(shí)，因?yàn)闇囟鹊纳卟⒉蛔阋云茐?'端與模板的結(jié)合，所以在Taq酶和鎂離子的作用下，引物的3'端會(huì)與dNTP結(jié)合，實(shí)現(xiàn)延伸。 這就意味著，如果3'端穩(wěn)定性極差，非常有可能在溫度達(dá)到72度時(shí)，引物從模板上脫落，造成延伸失敗。 換一種情況，如果3'端有錯(cuò)配，則溫度在55度時(shí)，引物極有可能錯(cuò)配。 當(dāng)溫度升高到72度時(shí)，溫度所提供的能量不足以破壞3'端的錯(cuò)配，那就會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。這可不是我們所想要的。 在5'端穩(wěn)定性大于3'端穩(wěn)定性的情況下 我個(gè)人認(rèn)為，當(dāng)溫度穩(wěn)定在55度時(shí)，是5'端結(jié)合在了模板上，3'端處于游離狀態(tài)，事實(shí)是否這樣，我不知道。 假定我的認(rèn)為是正確的，那當(dāng)溫度72度時(shí)，3'端已經(jīng)有一大部分結(jié)合在了模板上。同上，可以實(shí)現(xiàn)延伸。 在這種情況下，3'端的自由能越大，在72度時(shí)，3'端與模板結(jié)合的越多。相反，3'端自由能越小，那結(jié)合的越少，小到一定程序，有可能就根本無(wú)法延伸。 在實(shí)現(xiàn)情況下，引物100%的有錯(cuò)配，所以，由此可知，引物的3'端的自由能，不要太高，但也不要太低。 給出一個(gè)參考值: 9 > abs(dG) > 4。5 |
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2樓2019-03-01 10:20:00
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