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diguoxueye金蟲(chóng) (正式寫手)
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[交流]
關(guān)于果蔬中過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定 已有1人參與
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我在做POD和CAT酶活力測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些異常現(xiàn)象。我是采用測(cè)吸光值測(cè)定結(jié)果的。發(fā)現(xiàn)吸光值呈現(xiàn)異常變化情況。比如測(cè)CAT時(shí)發(fā)現(xiàn)，有的吸光值不斷的下降，有的樣品的吸光值先在測(cè)定的最初1min內(nèi)急劇下降，隨后，有的是下降速度明顯降低，有的是呈增加的趨勢(shì)。還有的樣品是吸光值在前1分鐘內(nèi)先升高，隨后，呈現(xiàn)規(guī)律的下降趨勢(shì)。測(cè)定POD也出現(xiàn)了同樣的問(wèn)題。但是，以前測(cè)定POD的時(shí)候，曲線的R平方值非常大，基本上都是0.99以上的。現(xiàn)在和以前的最大差別在于，兩次的樣品不同，但是都屬于同一個(gè)品種，現(xiàn)在測(cè)定的酶活比以前測(cè)定的小很多。 補(bǔ)充一點(diǎn)：我的分離方式采用的是過(guò)濾，而不是離心。主要是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)離心的效果比較差，又沒(méi)有高速離心機(jī)。最后發(fā)現(xiàn)過(guò)濾的溶液還是比較澄清的。 下面的是POD的測(cè)定方法 7、過(guò)氧化物酶活力測(cè)定 (1) 試劑 0.02mol/L KH2PO4溶液，0.1molPH6.0磷酸緩沖液，反應(yīng)混合液（取0.1mol/LPH6.0磷酸緩沖液50mL，加入愈創(chuàng)木酚0.028mL，于磁力攪拌器加熱攪拌至溶解，待溶液冷卻后，加入30%過(guò)氧化氫0.019mL，混合均勻，于冰箱中保存）。 (2) 試驗(yàn)方法 a) 粗酶液的提�。悍Q取1.0g植物組織，放入研缽中，加入少量石英砂和0.02mol/L KH2PO4溶液5mL，冰浴研磨成勻漿，于4000r/min下離心15min，上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中。所剩沉淀再用5mL0.02mol/L KH2PO4溶液提取一次，上清液并入容量瓶，定容至25mL，保存在冰箱備用。 b) POD測(cè)定：取比色杯2只，一只加入反應(yīng)混合液3mL和0.02mol/L KH2PO4溶液1mL，作為調(diào)零空白；另一只加入反應(yīng)混合液3mL和上述粗酶液1mL（如酶活力過(guò)高可稀釋），立即開(kāi)啟秒表計(jì)時(shí)，于分光光度計(jì)470nm處比色測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)一次。 c) 結(jié)果計(jì)算：以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01為1個(gè)POD活力單位，計(jì)算活力： POD活力（U/gFW/min）= 式中：△OD470——反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化量； W——植物組織鮮重（g）； t——反應(yīng)時(shí)間（min）； Vt——提取酶液總體積（mL）； Vs——測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。 CAT測(cè)定采用 樣品提取是采用的磷酸鹽緩沖液，測(cè)定吸光值時(shí)，2.9mLTris-HCl緩沖液+0.05mL750mmol/L過(guò)氧化氫+0.05mol/L粗酶液，在240nm下測(cè)定吸光值。每30s測(cè)定一次吸光值。 |
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2樓2014-12-19 10:16:43
你好青橄欖
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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為什么酶夜提取時(shí)用的是KH2PO4，而不是混合液中的緩沖液？用同樣的緩沖液可以嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2015-11-10 18:34:11
xsy_vvvv
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